Faculté des Sciences
Université d’Orléans

Travaux Pratiques de Biotechnologie Appliquée

Biotechnologie végétale et animale

BBMB 2011/12

Conjugaison triparentale 1. Introduction Le but de cette experience est d’étudier le processus de conjugaison triparentale et de déterminer son efficacité. Pendant ce processus une conjugaison simultanée de trois souches bactériennes se produit. Nous utilisons une souche donneuse d’E. coli qui dans son plasmide (pKY70GIN) contient le gène d’interêt (GUS-intron), une souche receveuse d’A. tumefaciens et une troisième souche « helper » d’E. coli. Celle-ci contient les éléments nécessaires à la conjugaison entre la souche receveuse et donneuse. La quatrième souche de bacteries qui posséde déjà le plasmide pKY70GIN est utilisée comme un témoin positif. Après incubation des trois souches bacteriennes nous effectuons une double séléction positive d’agrobacteries contenant le plasmide pKY70GIN. Cette séléction est possible car la souche receveuse posséde le gène de résistance à la gentamycine et les souches donneuse et helper le gène de résistance à la kanamycine. Ainsi donc apres incubations des bacteries sur le milieu LB contenant les deux antibiotiques (LB-GK), nous obtenons le nombre d’agrobacteries dans lesquelles le plasmide pKY70GIN a été introduit. Comparant cette valeur avec le nombre de colonies qui ont poussé sur le milieu LB-G (toutes les agrobacteries dans la colonie) nous sommes capables de determiner l’efficacité de la conjugaison triparentale. 2. Résultats Les resultats de cette experience sont presentés dans le tableau. Les dilutions des colonies initiales sont notées à côté. | Nombre de colonies bacteriennes | | Souches dans la culture bacterienne | Milieu LB-GK | Milieu LB-G | Efficacité | Donneuse, receveuse, helper 10-4 | 5 | 220 | 2.3% | Donneuse, receveuse, helper 10-3 | 49 | 1030 | 4.8% | Donneuse, receveuse, helper 10-2 | 336 | | |