|GOSSE Marianne |Master 1 PVIA |
|MBELE Gelsie |Semestre 2 |
|MOREAU Eric | |

Travaux pratiques de génétique appliquée :

Vérification de l’expression d’un transgène par l’utilisation de plusieurs techniques de biologie moléculaire

Trinôme N°3

Lors de ce TP de génétique appliqué, il nous a été demandé d’étudier le gène nptII. Ce gène code une résistance à la kanamycine, qui est un antibiotique.
Nous allons utiliser des plantes d’Arabidopsis possédant ce gène, elles sont donc capables de se développer sur un milieu contenant de la kanamycine.
Pour vérifier la présence ou non de ce gène dans nos plantes, nous allons réaliser l’expérience avec un témoin sauvage (donc sensible à la kanamycine) à titre comparatif, en utilisant plusieurs techniques de biologie moléculaire.
Par le biais de ces techniques, nous allons utiliser en premier lieu une sonde marquée à la digoxygénine pour révéler les transcrits, utiliser une technique de RT-PCR pour amplifier l’ADNc à partir de l’ARN et quantifier les transcrits par Southern Blot.

I. Première séance : préparation de la sonde marquée à la digoxygénine

Cette séance consiste à extraire l’ADN plasmidique et à le quantifier grâce à des mesures d’absorbances à 260 et à 280 nm. Cette ADN vas nous permettre de réaliser la sonde nptII et un témoin positif T+ par PCR.

1) Extraction d’ADN plasmidique à partir d’E. coli et quantification

Nous avons réalisé l’extraction à partir d’une pré-culture d’Escherichia coli ayant le gène nptII qui a été incubé à 37°C pendant une nuit avant la séance.
Après centrifugation de l’inoculum puis élimination du surnageant,