Bgal

Pages: 8 (1833 mots) Publié le: 11 avril 2012
Activité de la β-galactosidase-
Méthodes de mesure de vitesses de réaction [P] = f (t)

Introduction
L'organisme est constitué de nombreuses protéines. Parmi celles-ci on distingue les
enzymes, des catalyseurs biologiques intervenant dans les réactions biochimiques.
Comme leur nom l'indique, leur unique rôle est de catalyser une réaction c'est à dire de
faciliter celle-ci sans modifierles produits formés. Une enzyme agit sur un substrat pour le
transformer en un produit sans intervenir dans l'équilibre de la réaction. De plus, une des
particularités des enzymes est de rester intacte au cours de la réaction ce qui lui confère la
capacité de catalyser plusieurs réactions successives.

La β-galactosidase est une enzyme qui hydrolyse le lactose en glucose + galactose et qui aune spécificité large ce qui lui permet d'hydrolyser les β-galactosides tels que l'ONPG, également appelé le 2-nitroplényl-β-D-galactopyranoside, en galactose + ONP (ou 2-nitrophénol), un produit jaune en milieu alcalin et absorbant à 415nm.

La recherche de la β-galactosidase est utilisée en bactériologie afin d'identifier une bactérie.
En effet, la dégradation du lactose chez une bactériepeut être un caractère discriminant pour
certaines espèces. La première β-galactosidase à avoir été séquencée est d'ailleurs celle d'une
bactérie très connue : Escherichia coli.

Chez les humaines, cette enzyme diffère par sa séquence en acides aminés soit 677 acides aminés contre 1024 chez Escherichia coli.
Nous pouvons alors nous demander comment agissent ces enzymes et notamment à quellevitesse agissent-elles ?

Le but de ce TP est d'étudier la vitesse initiale d'une réaction catalysée par la β-galactosidase en comparant deux techniques de détermination de vitesses différentes. La valeur de cette vitesse permet, par la suite, de déterminer la concentration du produit formé.

Matériel et Méthodes
Matériel
Pour les 2 méthodes, est nécessaire :
Un tamponphosphaté pH 7 (avec Mg2+ et β-ME)
De l'ONPG à pH 7 à 2,5mmol.L-1
Une solution enzymatique de β-galactosidase
D'une pipette de 200-1000µL et de 1-5 mL + cônes adaptés
D'un vortex
Des béchers (pour l'ONPG, le réactif d'arrêt et la solution tampon)
D'un bac de glace (pour maintenir l'ONPG et l'enzyme à faible température)

Pour laméthode en continu, nous avons besoin :
D'un spectrophotomètre thermostaté à 30°C
D'un chronomètre
D'une cuve à spectrophotomètre
Du parafilm

Pour la méthode par points, il faut :
Un spectrophotomètre
Un bain thermostaté à 30°C
10 tubes à hémolyse
Du réactif d'arrêt (Na2CO3 à 1mol.L-1 qui amène le pH à 11)
2 cuvesdifférentes à spectrophotomètre

Méthodes
Méthode en continu

Cette méthode est mise en œuvre quand le produit ou le substrat absorbe. Dans ce cas-là, on détermine la vitesse initiale grâce à la pente de la partie linéaire de la courbe P=f(t).
Cette méthode consiste à introduire dans une cuve à spectrophotomètre 0,4mL de substrat (l'ONPG) et 2,4mL de solution tampon à pH7 ensuite préchauffés dansle spectrophotomètre thermostaté afin que le milieu réactionnel soit à bonne température. Puis 200µL d'enzyme (la β-galactosidase) sont introduits dans la cuve et on mesure l’absorbance du milieu régulièrement pendant 15 minutes. Ainsi on établit une courbe de l'absorbance en fonction du temps. La pente de la partie linéaire de la courbe (première partie) permet de déterminer la vitesse initialede réaction.

Méthode par points

Cette méthode consiste à arrêter la réaction à différents temps en inactivant l'enzyme grâce à du réactif d'arrêt (ici le carbonate de sodium). On dose ensuite le produit formé ou le substrat disparu.
Dans 11 tubes à hémolyse, on introduit 0,4mL de substrat (l'ONPG) et 2,4mL de tampon phosphaté à pH7. Le mélange est préchauffé au bain thermostaté à...
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