Pdf TP Enzymo 2

Pages: 8 (1939 mots) Publié le: 14 juillet 2015
UNIVERSITE DE NOUAKCHOTT
FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

TRAVAUX PRATIQUES DE BIOCHIMIE
ENZYMOLOGIE
Troisième année Biologie et STA1

Elaboré par :
Ali O. Med Salem O. BOUKHARY

2009-2010
0

SOMMAIRE

Etude de l’activité de la b-fructofuranosidase (invertase) de la
levure
TP 1. Extraction de l’invertase de la levure et étalonnage d’une solution
standard de glucose +fructose pour la méthode a l’acide dinitrosalicylique
(DNS)
TP 2. Détermination de la vitesse initiale d’une réaction enzymatique
TP 3. Détermination des constantes cinétiques KM et Vmax d’une réaction
enzymatique
TP 4. Etude de l’influence du pH et de la température sur une réaction
enzymatique

1

Extraction et étude de l’activité de la b-fructofuranosidase (invertase)
de la levureGENERALITES
Le saccharose est le plus répandu des diholosides, Il est extrait de la betterave et de la
20
canne à sucre. C'est un sucre non réducteur dextrogyre ( [a ]D = +66,5° ) qui par hydrolyse
chimique ou enzymatique, libère un mélange équimolaire de glucose et de fructose, tous deux
20
réducteurs. Leur pouvoir rotatoire global est lévogyre ( [a ]D = -20°) ). On donne ainsi à ce
mélange le nom de sucreInverti. (Inversion du pouvoir rotatoire).
L'inverstase ou ß-fructofuranosidase est une hydrolase capable de scinder le saccharose en
glucose et fructose par rupture des liaisons ß-fructofuranosiques.
α-D-glucopyranosyl (1®2) ß-D-fructofuranoside (Saccharose)
H2O

Invertase

α-D-glucopyranose + ß-D-fructofuranose
(Glucose)
(Fructose)
L'activité enzymatique de l’invertase peut être étudiée endosant les sucres réducteurs
libérés après hydrolyse par une des méthodes suivantes :
- En mesurant la variation du pouvoir rotatoire en fonction du temps d'hydrolyse
- La méthode au ferrocyanure de potassium
- La méthode à la glucose-oxydase
- Par réduction à la liqueur de Fehling
- La méthode à l’acide 3,5-dinitrosalicylique ou DNS (c'est cette dernière que nous
utiliserons)
Pour une enzyme ondéfinit d'une part :
- L'unité A comme la quantité d'enzyme qui libère l mg d'hexose réducteur
(glucose plus fructose) en 3 minutes.
- L'activité enzymatique comme le nombre de micromoles de saccharose
hydrolysé par mn.
-

L'activité spécifique comme le nombre de micromoles de saccharose
hydrolysé par mn et par mg de protéines solubles.

BUT :
Il s'agit d'extraire la fraction soluble de la levure deboulangerie, de mettre en évidence
l'activité invertase dans l'extrait cellulaire et de déterminer les conditions optimales de cette
activité enzymatique. Ces expériences illustrent le mode d'action des enzymes en général.

2

TP 1. EXTRACTION DE L’INVERTASE ET ETALONNAGE D’UNE
SOLUTION STANDARD DE GLUCOSE ET FRUCTOSE POUR LA METHODE A
L’ACIDE 3,5 DINITROSALICYLIQUE (DNS)

A. EXTRACTION DE LAFRACTION SOLUBLE DE LA LEVURE DE
BOULANGERIE
L’invertase est une enzyme intracellulaire, son extraction nécessite obligatoirement la rupture
de la membrane cellulaire.
1 - Matériel et réactifs
- levure de boulangerie (Saccharomyces cerevisiae)
- pipettes
- éprouvettes
- centrifugeuse
- tubes à centrifuger (2/binôme)
- flacons pour la congélation
- bicarbonate de sodium à 0,1M (préparation : 8,4 gdans 1L eau distillée)
2 - Mode opératoire
- Suspendre 10g de levure de boulangerie dans 40 ml de bicarbonate de sodium à 0,1M
- Incuber à 35-40°C pendant 24H
- Centrifuger à 5000 tr/min pendant 5 min
- Après centrifugation, récupérer le surnageant contenant les molécules solubles entre
autres l’invertase.
- Jeter le culot formé de débris cellulaire
- Noter le volume total de surnageant(éprouvette).
- Conserver le surnageant au froid pour les manipulations ultérieures.
B. GAMME D'ETALONNAGE POUR LA METHODE COLORIMETRIQUE A
L’ACIDE DINITROSALICYLIQUE
En milieu alcalin et à chaud, l’acide 3,5-dinitrosalicylique (3,5-DNS) jaune est réduit par
les oses réducteurs en acide 3-amino 5-nitrosalicylique rouge orangé.

Sucre
réducteur

Acide 3,5-dinitrosalicylique (jaune)

Sucre oxydé

Acide...
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