DNA extraction protocol

• Broyer ~150 mg de feuilles finement ciselées dans 300 µl de tampon d’extraction préchauffé à 74°C à l’aide d’un mortier et pilon • Lorsque le broyage est complet ajouter encore 300 µl de tampon d’extraction et transférer le broyat dans un tube eppendorf de 1.5ml • Bien mélanger au vortex • Incuber à 74°C pendant 30 min au bain marie • Refroidir a température ambiante • Ajouter 500 µl de chloroforme/isoamylalcool (24:1) • Mélanger lentement par inversions pendant 3 min • Centrifuger à vitesse maximale (4000rpm ou 12000g) à température ambiante pendant 15 min • Transférer le surnageant (~420 µl) dans de nouveaux tubes • Ajouter 270 µl d’isopropanol froid • Agiter par inversion jusqu’à la formation d’une pelote et mettre à -20°C pendant 15 min • Centrifuger 15 min à vitesse maximale • Vider délicatement le surnageant en prenant garde de ne pas faire tomber les culots • Ajouter 100 µl d’éthanol absolu (90) froid • Centrifuger 10 min à vitesse maximale • Jeter le surnageant en prenant garde de ne pas faire tomber les culots • Sécher sur la paillasse • Ajouter 40 µl de TE 0.1x et laisser suspendre quelques heures à température ambiante, puis mélanger à la pipette. Stocker à -20°C • Vérifier la concentration (spectrophotomètre, DO260 and 280 nm) et la qualité de l’ADN extrait (gel d’agarose 1%).

DNA extraction buffer Tris 100 mM pH 8 EDTA 20 mM pH 8 NaCl 1.4 mM MATAB 3 % Bisulfite de sodium 0.5 %
Chauffer à 74°C avant d’ajouter le MATAB et bisulfite de sodium (BS)

PCR reaction mix (25 µl)

dH2O 17.4 µl
10x PCR buffer 2.5 µl
10 mM dNTPs 1 µl
Primer for (10mM) 1 µl
Primer rev (10mM) 1 µl
Taq SBS [5U µl-1] 0.1 µl
DNA template [25 ng µl-1] 2 µl

Digestion mix with Bsp1286I (20 µl)

PCR product 15 µl
10x buffer No4 2 µl dH2O 2.8 µl