TP LDH

1599 mots 7 pages

La Lactate déshydrogénase.

Lactate déshydrogénase : purification partielle par chromatographie d'affinité

La lactate déshydrogénase (LDH) est une enzyme qui catalyse la conversion réciproque de la pyruvate et de la lactate accompagnée de la conversion concomitante du NADH en NAD+ (et inversement). Ce tétramère est composé de 4 sous unité (isoenzyme) différents de par leurs constances cinétiques et leurs pH isoélectriques.

Introduction :
Dans cette manipulation nous cherchons à séparer les différents monomères de l’enzyme tétramérique. Pour cela nous allons procéder par différents procédés tels que : L’extraction, la purification, la mesure de l’activité enzymatique par spectrophotométrie, des électrophorèses et pour finir des dosages de protéines.
L’extraction et la purification : vont nous permettre d’obtenir une enzyme lavée de toutes les molécules « parasites » (comme les protéines ou les inhibiteurs).
La mesure de l’activité par spectrophotométrie : va nous permettre d’identifier l’enzyme dans les différents tubes et nous permettre de voir son activité.
L’électrophorèse : va nous permettre de voir à quelle type d’enzyme nous avons vraiment à faire et savoir sa composition notamment sa composition en monomères.
Le dosage : va nous permettre de savoir combien nous avons de gramme de protéine dans nos solutions.

Avant de débuter nous pouvons tout d’abord souligner que le bleu de Cibacron est un analogue du cofacteur de la LDH : le NADH et le NAD+.

A. Extraction et purification partielle des isoenzymes du tissu.

Purification partielle sur gel de bleu de Cibacron.

Le principe de la chromatographie d'affinité repose sur l'attirance entre l'enzyme et sont substrat. On choisit ici d'isoler l'enzyme sur gel de Cibacron analogue du NAD+ (bleu de Cibacron fixé par covalence à une phase stationnaire dans une colonne). L'enzyme se fixe alors de manière non covalente au bleu, laissant ainsi les impureté (autres protéines) passer entre

en relation

Purification de la ldh
1129 mots | 5 pages

LA LACTATE DÉSHYDROGÉNASE La lactate déshydrogénase ou LDH est une enzyme qui catalyse la réaction suivante : L-lactate + NAD⁺ <==> pyruvate + NADH + H⁺ Cette réaction permet pour la plupart des mammifères et des bactéries de faire de la fermentation lactique soit la réoxydation des cofacteurs (ici NADH,H⁺) en anaérobiose. Objectif : L'objectif de ce travail pratique est de purifier une protéine, en l'occurrence la LDH mais de façon partielle à partir d’un extrait cellulaire de tissu bovin foetal au moyen d’une chromatographie d’affinité sur bleu Cibacron. (le bleu Cibacron a une structure proche du NAD⁺ qui est un cofacteur de la réaction impliquant la LDH d'où son utilisation) Principe de la chromatographie d’affinité :….

montre plus
Comte rendu Tp LDH
580 mots | 3 pages

1 L lactate + NAD+ Pyruvate + NADH + H+ 2 Le but de ce TP est de purifier cette LDH à partir d’un mélange d’extrait de foie de rat en utilisant un technique de chromatographie liquide en milieu non dénaturant, plus spécifiquement une chromatographie d’affinité avec comme ligand pour fixer notre LDH un analogue du NADH qui est ici le bleu de Cibacron qui est relativement peu spécifique permettant la purification que d’un groupe de protéines : la purification de la LDH ne sera donc que partielle. La chromatographie d’affinité : Méthode basé sur l’utilisation d‘une phase stationnaire constituée d’un support (silice, polymère) sur lequel on a greffé un Ligand qui présente une affinité sélective pour certains….

montre plus
Tpe.sl
552 mots | 3 pages

Une enzyme est une protéine qui joue un rôle de catalyseur biologique, c'est à dire qui augmente la vitesse de réaction. Elle facilite une réaction biochimique, transformation chimique d'une substance en une autre substance à l'intérieur du corps. Sans pour autant en modifier les produits. Elle est capable d'abaisser l'énergie d'activation, donc la quantité d'énergie nécessaire pour lancer un processus chimique et ainsi d'accélérer les réactions chimiques du métabolisme mais sans modifier l'équilibre formé. Les enzymes agissent à faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de réaction.….

montre plus
Tp adh
1581 mots | 7 pages

ALCOOL DESHYDROGENASE Cette enzyme, extraite de la levure de bière, catalyse la réaction suivante : C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH + H+ Dans cette équation, l’éthanol est le substrat et le NAD+ joue le rôle de coenzyme. Le relargage d'ions….

montre plus
Article_Il_y_a_cent_ans_naissait_le_pH
5313 mots | 22 pages

En 1909,le biochimiste danoisS.P.L.Ssrensen,comprenantque les vitessesdes réactionsenzymatiques dépendaientde la concentration des ions hydrogèneet non de l'aciditétotale,inventaitle pH. Rapidement adoptépar les biochimistes, le pH fut plustardivement acceptépar les chimistes,pluscritiques,et qui n'en qui, depuisle milieu pas de suiteI'utilité. Aprèsavoirévoquéles progrèsde la physico-chimie ressentirent puiscelui du XlXesiècle,furentle préludeà I'introduction du pH, cet articleprécisele contextede I'invention, le pH, sous son de la mutation,en 1924,de la grandeurpH en pas. Maisau termed'un siècled'existence, poséespar sa mesure,car apparentebanalité,soulèveencoredes questions:d'abordles interrogations valide, l'activitéd'un ion individuel n'estpasdirectement mesurablepar une méthodethermodynamiquement maiségalementles questionsfondamentales relativesà la structurede l'ionhydrogèneet à sa mobilité. La versatilité de cetteespèce,traduitepar la formuleH(H2O)n-, et sa propagation en relationavecla dynamique des liaisonshydrogènede I'eau, sont autant de sujets qui continuentà passionnerles chercheurs d'aujourd'hui, de la chimieà la biologie. pH, ion hydrogène,H+,proton, Sorensen.….

montre plus
LA PAL
1856 mots | 8 pages

-Calculer la vitesse initiale de la réaction (vi) en mol / L de mr / min (on considèrera la vitesse de la réaction égale à 0 lorsqu'il y a absence d'enzyme). II. PAR METHODE POINT PAR POINT L'enzyme étudiée est la b fructosidase qui est une hydrolase capable de scinder les liaisons b fructofuranosiques. La réaction utilisée est l'hydrolyse du saccharose (glucide non réducteur) en fructose et glucose (glucides réducteurs) en….

montre plus
Obtenir l isocitrate déshydrogénase
305 mots | 2 pages

I- But : Le but de ce TP est d’obtenir l’isocitrate déshydrogénase (IDH) par voie recombinante. On utilise comme système d’expression E.coli (souche JM109) transformé par le plasmide pGEX-2T dans lequel on a inséré le gène de l’IDH. L’IDH recombinante exprimée est en fusion avec la glutathion-S-transférase (GST) à des fins de purification par chromatographie d’affinité sur une colonne glutathione sepharose 4B. L’IDH peut être étudiée et dosée après clivage de la protéine de fusion par la thrombine. II- Principes III- Interprétations des résultats….

montre plus
Compte rendu de tp : purification de lysozyme à partir de blanc d'oeuf
2272 mots | 10 pages

Compte rendu de TP Purification de lysozyme I/ But Le but de ce TP est la purification de lysozyme, une enzyme qui se localise dans le blanc d’œuf. Pour ce faire, nous allons procéder en trois grandes étapes : 1) Dans un premier temps, nous utiliserons la chromatographie d’échanges d’ions pour séparer les constituants de notre mélange. 2)….

montre plus
Tp phosphatase alcaline
1622 mots | 7 pages

I. Introduction Le but de cette manipulation est de déterminer les paramètres cinétiques d’une enzyme afin d’étudier l’influence de la concentration en substrat et de la présence d’un inhibiteur sur la vitesse de réaction. Dans ce TP, nous allons utiliser une préparation commerciale de phosphatase alcaline de veau. Il s’agit d’une enzyme alcaline à 2 substrats, capable d’hydrolyser les monoesters phosphoriques selon la réaction suivante : R-O-PO3….

montre plus
svt climat
605 mots | 3 pages

TP : influence du milieu sur l'activité des enzymes ETAPE 3 : Nous avions donc 8 tubes à essais chacun ayant un mélange d'empois d'amidon et d'eau iodée ainsi que 8 tubes dont 4 avec chacun 2mL d'eau distillée et 4 autres avec chacun 2mL d'alpha-amylase. Dans le récipient avec l'eau glacée on a : le tube 1 qui contient 2mL d'eau distillée le tube 1' qui contient 2mL d'alpha-amylase….

montre plus
Super dissert
723 mots | 3 pages

TP Les enzymes : catalyseurs biologiques des réactions chimiques des cellules des êtres vivants Dans les cellules des êtres vivants, des molécules sont synthétisées et dégradées grâce à des réactions chimiques. Touts ces réactions chimiques sont catalysées par des enzymes, en effet les enzymes permettent l’accélération des réactions tout en retrouvant leur état initial à la fin de chacune des réactions. Dans le tubercule des pommes de terre, les enzymes permettent la synthèse d’amidon, elles permettent la polymérisation de petites molécules en macromolécules d’amidon. Nous cherchons à savoir comment s’effectue la polymérisation. A/ Préparation d’un filtrat de pomme de terre : * peler une pomme de terre * prendre 70g de la pomme de terre pelée * la râper et la broyer dans 50ml d’eau distillée avec un mortier refroidi * filtrer avec un papier filtre sur un entonnoir refroidi, dans un bécher placé dans la glace * laisser le tubercule de pomme de terre….

montre plus
Tp lactate
263 mots | 2 pages

Lactate déshydrogénase : purification partielle par chromatographie d'affinité La lactate déshydrogénase (LDH) est une enzyme présente dans une grande diversité d'organismes, aussi bien végétaux qu'animaux. Elle catalyse la conversion réciproque de la pyruvate et de la lactate accompagnée de la conversion concomitante du NADH en NAD+ (et inversement). Ce tétramère est composé de 4 sous unité (isoenzyme) différents de par leurs constance cinétiques et leurs pH isoélectriques. Le but de ce TP est de purifier la LDH (ici de façon partielle) au moyen d'une chromatographie d'affinité en colonne.….

montre plus
Compte rendu LDH
743 mots | 3 pages

La lactate déshydrogénase (LDH) est une enzyme tétramérique catalysant la conversion réciproque du pyruvate et du lactate accompagnée de la conversion simultanée du NADH en NAD+ (et inversement). Ce tétramère est composé de deux types de sous-unités différents M et H, et pouvant s'associer en cinq isoenzymes différentes. Le but de ce TP est de purifier la LDH, ici de façon partielle, au moyen d'une chromatographie d'affinité en colonne. Le principe….

montre plus
TPE PDM
701 mots | 3 pages

La peine de mort sera discutée aujourd'hui comme sujet de TPE, il entrera dans le thème de « Responsabilité et Ethnique » proposée cette année. Aujourd'hui, dans le monde, 58 pays prononcent encore des peines capitales mais seulement 23 de ces pays ont procédé à des exécutions en 2010. C'est pendant des millénaires que la mort est le châtiment suprême jusqu'à de nos jours. « Cette mise à mort était considérée comme une réparation nécessaire pour établir l'ordre social rompu par le crime.….

montre plus
Purification du lysozyme
2597 mots | 11 pages

Les constituants d'un mélange se séparent le long d'une phase stationnaire par entraînement d'une phase mobile. Chaque soluté est soumis à une force de rétention (exercée par la phase stationnaire) et une force de d'entrainement (due à la phase mobile). La séparation en chromatographie d'échangeuses d'ions dépend de l'adsorption réversible de molécules chargées sur des groupes échangeurs d'ions immobilisés de charges opposées. Les ions liés par interactions électrostatiques (liaisons ioniques) à un support insoluble et chimiquement inerte, sont remplacés de manière réversible par les ions en solution dans la phase mobile.….

montre plus