Purification du lysozymeBut :Le but de ce TP est de purifier un lysozyme, qui est une enzyme présente dans le blanc d’œuf. Pour cela, nous allons, dans un premier temps, séparer les constituants de notre mélange grâce à une chromatographie échangeuse d’ions, puis nous allons doser l’activité enzymatique du lysozyme par dosage spectrophotométrique. Enfin, nous allons réaliser un dosage de protéine grâce au réactif de Bradford et une gamme étalon. Principe :Chromatographie …afficher plus de contenu…

Il est essentiel de réaliser a mesure de l'absorbance des essais en même temps que la gamme. Mesure de l’activité enzymatique : le lysozyme est une enzyme hydrolysant les liaisons β-1,4 entre l’acide N-acétylmuraminique et les résidus 2-acétamido-2 desoxy D glucose des mucopolysaccharides des parois bactériennes. L’activité enzymatique est déterminée à partir de la propriété du lysozyme à hydrolyser les parois, et est mesurée à l’aide de mesure spectrophotométrique à …afficher plus de contenu…

Et Vi(B)= 24,6mL de carbonate de sodium. Nous allons ensuite préparer notre résine, pour ce tp nous choisirons la CM-Cellulose, une résine échangeuse de cations, c’est-à-dire chargée négativement. On introduit une solution de blanc d’œuf, la majorité des protéines présentes dans cette solution ont un Pi entre 6 et 7, sauf le lysozyme qui lui a un Pi égal à 11.Pour un pH < Pi, les protéines ont une charge positive, alors que pour un pH > Pi, elles ont une charge négative. Dans notre cas, étant donné que le pH est à 10, le lysozyme est la seule protéine qui se fixe à la résine. Nous allons dans un premier temps mesuré par spectrophotométrie l’activité enzymatique avec du lysozyme commercial afin de déterminer la zone de proportionnalité. En faisant varié la quantité d’enzyme nous avons mesuré la pente, les résultats sont les suivants : Volume d’enzyme (nL)0255075100150200Pente