Bromure d'éthidium

remplir d’eau. • La migration se fait du Pole négative (noir) vers Le pole positive (rouge). La détection de l’ADN sur ce type de gel est réalisée par exposition aux rayons UV après réaction avec un réactif spécifique qui est le BET = Bromure d’éthidium . C’est un agent très cancérigène qui s’intercle entre les deux brins d’ADN . Résultat : ADN Génomique est le plus lourd, pas de migration . ADN super enroulé est plus léger. Il migre le plus rapidement. ADN Linéaire et circulaire Ont la même

Digestion 18 4- Visualisation des fragments de restriction (électrophorèse) 19 An Introduction to Genetic Analysis Visualisation des fragments d’ADN (électrophorèse) L’ADN à une charge négative !!!! Gel agarose Banc UV Bromure d’ethidium Quoi espérer ? Photo 20 5- Étape de Ligation Au cours de cette étape on va produire l’ADN recombinant LIGASE - 2µl plasmide pBluescript - 2µl d’ADN du phage - 10 µl tampon X2 - 3µl d'eau - 2µl de tampon de dilution - 1µl Ligase Soit

taille, les plus petits avancent plus vite suivis par les plus grands. Un plasmide très enroulé se comporte comme une petite molécule. Il a fallu migrer en parallèle avec les fragments digérés marqués pas le tampon bleu un marqueur de taille. Le bromure d’ethidium ou BET nous a servi de marqueur intercalant et va nous permettre de visualiser le résultat car en présence de rayon Ultra Violet il peut émettre de la fluorescence et le tampon bleu de charge a indiqué le front de migration. Pendant ce TP,

par une opération de séparation magnétique unique et rapide. Méthode d’extraction et de purification au CTAB élaboré pour la première fois par Murray et Thompson en 1980 (Murray et Thompson, 1980), le protocole du test au cétyltriméthylammonium bromure (CTAB) a été publié ultérieurement, et plus précisément en 1987, par Wagner et ses collègues (Wagner et al., 1987). La méthode convient pour l’extraction et la purification d’ADN de végétaux et d’aliments tirés des végétaux et convient particulièrement

puis coloration au bleu de bromophénol. 2. Prélèvement des échantillons pour une électrophorèse en gel d’agarose (90 mV/1h) : les fragments les plus courts migrent vers l’anode plus vite que les fragments longs. 3. Coloration de l’ADN par le bromure d’éthidium : une couleur rougeâtre est révélée sous UV (254 nm). 4. L’ADN bicaténaire est soumis à un traitement alcalin pour séparer les deux brins. 5. On pose une membrane de nitrocellulose ou de nylon sur le gel d’agarose, puis sur cette membrane est

d’agarose : * On pèse 0,5 g d’agarose dilué dans un tampon TBE (triborate d’EDTA) 0,5X (50 mL) (ne pas agiter) et on porte à ébullition pour dissoudre l’agarose. * Mettre l’erlenmeyer sur du papier absorbant. * Disposer 0,35 µL de bromure d’éthidium (agent intercalant des acides nucléiques) attention ce produit est cancérigène donc ne pas inhaler les vapeurs ! * Mélanger et couler à chaud. Il faut que le gel ne soit pas trop épais ni trop peu épais. * Attendre que le gel polymérise

facilité avec laquelle elles progressent à travers le gel d’agarose. La séparation est ainsi assurée par l’effet de filtration du gel. Plus une molécule est lourde moins elle migre. Après l’électrophorèse, le gel à été immergé dans une solution de bromure d’éthidium . Finalement on photographie le gel sous une lumière UV. Résultats Nos résultats sont le puits 7 pour le digéré, et le 8 pour le non digéré. Le puits représente le marqueur, et le puits 15 le témoin Interprétation Conclusion Ce

insérer dans les puits de notre gel, et la migration est effectuée dans une dans un appareil d’électrophorèse à champ pulsé et conduite en tampon réfrigéré (14°C) continu de TBE 0,5X , et après migration, le gel est coloré 30min à l’aide du Bromure d’ethidium à 0,5 mg/ml. Conditions de migration la migration est effectuée dans une dans un appareil d’électrophorèse à champ pulsé et conduite en tampon réfrigéré (14°C) continu de TBE 0,5X , et les pulses sont da 40 -120s à 6V/cm, sous l’angle

concentration faible en agarose, 0.8g agarose dans 100ml tampon TBE. Dans le cas d’un gel à 1%, la résolution du gel est plus faible. Les fragments d’ADN sont moins séparés ce qui donne des traces inexploitables. L’ADN sera révélé grâce au Bromure d’éthidium (BET), agent intercalent qui fluoresce après excitation aux UV et le glycérol va alourdir les dépôts et les entraîner au fond du gel, pour cela on utilise une solution de BEG. -En sachant que Vt=20µl pour un tube, le volume du BEG 6X a ajouté

au long de ce travail pratique ; Matériel | Produits | Micropipettes et embouts 0.5-10µl et 20-200 µl | 1 x tampon TBE | Microtubes Eppendorf 1.5 ml | Agarose en poudre | Support pour microtubes | Solution de bromure éthidium à 0.5µg/ml | Bloc chauffant | Solution d'ADN 1 et 2 | Centrifugeuse | Tampon de charge (blue/orange loading dye 6 x) | Cuve pour électrophorèse et accessoires | Enzyme de restriction PstI et XhoI | Table