Bromure d'éthidium

sera décroché une fois les lavages effectués grâce à de l’eau à 55°C. Cette purification est suivie d’une évaluation, sur gel d’agarose, de la quantité d’ADNc TAT purifié. Pour cela un gel d’agarose est préparé selon les volumes suivants : Bromure d’éthidium(Bet) 0.8µL 80mL 4µL Volumes Tableau I : Composition du gel d’Agarose Le Bet est un agent intercalant qui va se fixer entre les bases de l’ADN et va nous permettre de voir (aux UV) où a migré le contenu du puit. L’ADNc purifié des différents

planes. Elles sont grandes, elles peuvent s’intercaler : agents intercalents * Cela entraîne des phénomènes de réparation de l’ADN. Si la réparation n’est pas parfaite, il y aura des mutations (agents mutagènes = cancérigènes), tel que le bromure d’ethidium, l’acétylaminofluorène, le benzanthracène, … Autre possibilité de déformation : liaisons anormales entre 2 bases successives : Dimères de thymines. Les thymines possèdent un groupement méthyl, donc elles sont hydrophobes, donc elles ont la

fluorescence qui sera proportionnelle a la quantité de DNA présente. Les différents fluorochromes: -Se fixant spécifiquement sur des paires de bases: Bases A-T: Hoechst 332 et DAPI Bases G-C: mithramycine - Intercalants: Iodure de propidium, Bromure d'ethidium et Acridine orange ( qui ont l'avantage d'être moins chers ) Méthode basée sur la spectrophotométrie Le dosage s’effectue par spectrophotométrie dans l’ultra-violet à 260 nm. Il est indispensable de mesurer également l’absorption à 280

chargé négativement du fait de la présence de groupements phosphate, va migrer vers le pôle positif. Les fragments de plus petites tailles migreront plus rapidement et plus loin que les fragments de plus grandes tailles. A l'ADN sera ajouté du Bromure d'EThidium (ou BET), un agent intercalant servant à visualiser l'ADN sous rayons ultraviolets, ainsi que du bleu de charge. Celui ci va nous permettre de visualiser la migration. Il contient du glycerol (qui va rendre le mélange plus dense que le tampon

b) Conditions opératoires Le gel utilisé contient 0,8% d’agarose. Le tampon d’électrophorèse permet la migration sous une différence de potentiel de 50 V. c) Visualisation L’ADN sera révélé grâce au Bromure d’éthidium (BET), agent intercalent qui fluoresce après excitation aux UV. d) Purification Une bande du gel contenant l’ADN à purifier est découpée. Cette bande correspond à un fragment de taille connue. L'ADN de ces bandes est

enfin une étape d’élongation finale à 72°C pendant 5 mn. Après migration des produits d’amplification par électrophorèse en gel d’agarose à 1,5 %, à 100 V, pendant 2h, les profils d’amplification ont été révélés par coloration dans un bain de Bromure d’Ethidium concentré à 0,1 %. Les profils de typage ont été comparés visuellement. Au sein du même groupe phylogénétique, 2 souches ont été considérées comme identiques si elles présentaient exactement les mêmes profils d’amplification. Les profils

révélation au bromure d'éthidium (BET), qui est un agent d'intercalation fluorescent couramment utilisé comme marqueur d'acides nucléiques en laboratoire de biologie moléculaire. Lorsqu'il est exposé à des rayonnements UV, il prend une coloration rouge-orangée, 20 fois plus intense lorsqu'il est lié à l'ADN. Cet effet est du à l'augmentation de l'hydrophobie de l'environnement. Figure 2.28. : Bromure d’Ethidium : - En haut à gauche : exemple de révélation au bromure d’éthidium. - En

moléculaire il peut être utilisé pour séparer des protéines ou des acides nucléique, il permet le fractionnement D’ADN de 100 paires de base a plusieurs millions de paires de base. La détection des bandes D’ADN se fait par révélation direct par le bromure d’éthidium sous UV . LES APPLICATIONS 1er : analyse des protéines sérique analyse courante dans le domaine biologie et médicale le but est de séparer les protéines du sérum, d’identifier les fractions et déterminer le % relatif de chacune d’elle

ces 49µl, on rajoute 1µl d’ADN de queues extrait. Le dépôt s’effectue avec 40µl d’ADN et 5µl de tampon de charge (Bleu de Bromophénol 2%, glycérol 50%). La migration des produits de PCR s’effectue dans un gel d’agarose 2% (contenant du Bromure d’Ethidium) immergé dans un tampon TBE 1% (Tris Borate EDTA). Cette migration se réalise à 110mA. La révélation se fait aux UV. Le positionnement des amorces utilisées pour le génotypage des allèles SRF vous est présenté dans le schéma de la Figure

intercalants : ils peuvent s’insérer entre les bases (s’intercaler). Cette insertion introduit des contorsions de la double hélice et génère des délétions ou des insertions responsables de mutations par décalage du cadre de lecture. Exemple : le bromure d’éthidium, la proflavine, l’acridine orange. •Mécanismes biologiques de la réparation d’ADN Réparation par inversion directe 1) Correction d’épreuves Lorsqu’un nucléotide incorrect est inséré pendant la synthèse, l’ADN polymérase est capable de détecter