Bromure d'éthidium

TECHNIQUES GENERALES UTLISEES EN BIOLOGIE MOLECULAIRE ------------------------------------------------- Les extractions Elles sont utilisées à chaque fois que l'on souhaite éliminer des substances indésirables comme des protéines ou du bromure d'éthidium | | - Extraction phénolique: le phénol est un solvant organique qui dénature les protéines. Il est non miscible à l'eau et de densité supérieure à celle ci; les acides nucléiques n'y sont pas solubles. Après extraction par agitation

No. 60986-424 Nunc styrofoam -20°C benchtop coolers Bac de glace pilée Cylindre gradués de 100mL et 1L Erlenmeyer de 250mL avec barreau d’agitation magnétique Erlenmeyer de 150mL réservé au TBE 10X Bac scellé contenant une solution de bromure d’éthidium à 10mg/mL diluée 10000x dans du TBE 1x Instruments : Thermocycleur PCR (GBM-045) Microcentrifugeuse Micropipettes Gilson (p20, p200 et p1000) Agitateur Vortex Balance (Metler Toledo MS802S) Four à micro-ondes Bloc chauffant à 37°C et

1 ADN RECOMBINANT I. TECHNIQUES D’ÉTUDE DE L’ADN 1. Purification de l’ADN 1. Caractéristique de l’ADN L’Adn est en double hélice, il possède 10 nt/ tour d’hélice , 3,4nm/tour Le génome d’E. Coli possède un seul chr soit environ 4.10⁶ paires de bases ( pb ) La taille disproportionnée de la molécule d’Adn entraîne une grande sensibilité aux cassures mécanique lors de l’extraction. Étapes : Lyse des cellules Traitements chimiques, enzymatiques et physiques    Centrifugation 1. Pour la lyse

lorsque le gel est devenu solide, puis nous avons placé le gel et son support dans la cuve d’électrophorèse en immergeant les puits. Une fois la réaction enzymatique terminée, nous avons ajouté 2 µl de solution de dépôt composée de glycérol, de bromure d’éthidium (BET) qui sert à visualiser l’ADN et de bleu de Bromophénol dans les échantillons. En parallèle nous avons préparé deux tubes contenant 1µ d’ADN natif (non digéré) et 2µl de la solution de dépôt dans un volume final de 20µl. Nous avons

En PCR classique : 25 à 40 cycles sont effectués →225 à 240 copies (théoriques) 230 = 1 073 741 824 Réalité de l’amplification Visualisation de l’amplification Après coloration des acides nucléiques par un agent intercalant (BET ou bromure d’éthidium) Le milieu réactionnel : - La matrice (cible) - L’enzyme - Les oligonucléotides (5’ et 3’) - dNTP - MgCl2 - Autres L’ADN cible - Pas forcément purifié (lysat de cellules) - Pas en trop fort quantité : 10 ng dans 50 (inhibition de

Un produit de PCR d'une taille légèrement supérieure à 500 paires de bases 4. Fragment d'environ 4.5kb d'un Plasmide digéré par une enzyme de TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D’ANALYSE DES restriction ACIDES NUCLÉIQUES Formule du bromure d'éthidium Le bromure d'éthidium (EtBr) = à la fois un agent intercalant et un fluorochrome. Structure aromatique plane  s'intercaler entre les paires de bases  détorsion de la double hélice et émission de lumière (fluorescence) dans le rouge-orange lorsque le

placés dans une cavité ménagée dans un support gélifié. L’application du champ électrique oriente la migration des fragments d'ADN dans le gel. Après migration, les différents fragments (dits de restriction) sont révélés par « coloration » au bromure d'éthidium : ce produit s'intercale entre les bases d'une molécule d'acide nucléique, et fluoresce après éclairage aux ultraviolets : l'ADN apparaît alors sous forme de bandes à l'intérieur du gel, qui peuvent être traitées informatiquement :

génomique de cellules sanguines. Les produits de PCR sont ensuite digérés par l'une des deux enzymes. Lorsque le gène est inactif, tous les sites de restriction sont méthylés. Après digestion complète et séparation sur gel d’électrophorèse coloré au bromure d’éthidium, les résultats suivants sont obtenus: [pic] A. Les enzymes MspI et HpaII donnent des fragments à extrémités 3' sortantes. B. Le profil de la piste I peut correspondre à une digestion par l'enzyme HpaII. C. L’individu qui donne les

Brancher la cuve au générateur et le générateur à la prise de courant. Préférer un réglage de la tension à 100 V environ 1h30 à 2h. Coloration et observation Retirer délicatement le gel de la cuve et le placer dans un récipient contenant de bromure d’éthidium (BET) pendant 5 min. Rincer le gel dans un bain d’eau ou bien à l’eau courante sous le robinet. Placer le gel sur un rétroprojecteur pour une observation par la classe entière. Astuce : le BET est un intercalant à fluorescence rouge-orange

ribonucléases qui vont hydrolyser sélectivement ces acides nucléiques, en laissant l'ADN intact. Contrôle de l'extraction Analyse sur gel d'agarose révélée au bromure d'éthidium * Par électrophorèse sur gel d'agarose, on peut analyser la présence et la taille des acides nucléiques contenus dans la préparation. Ceux-ci sont révélés par le bromure d'éthidium, un colorant dont la fluorescence augmente très sensiblement quand il interagit avec l'ADN. Dans le cas d'une préparation d'ADN plasmidique, on observe