Électrophorèse

Pour cela il nous faut des fragments linéaires et purs. Pour obtenir ces fragments nous avons commencés par la digestion des plasmides pSK et pCR-gai par deux même enzymes de restriction. Ensuite pour séparer les produits de digestion on fait une électrophorèse sur gel d’agarose, les inserts seront purifiés du gel par la suite, puis nous les avons quantifiés pour ajuster les conditions de la ligation, cette dernière se fait en présence d’enzyme de ligation pour ligaturer l’insert au vecteur, On a

sucres, qui permet d'augmenter la densité des produits de PCR. Ainsi lors du dépôt, les produits de PCR tomberont au fond des puits et remplaceront alors les tampons. Une fois le programme de PCR terminé, nous ferons migrer nos produits de PCR par électrophorèse sur gel d'agarose 4%. L'agarose permet de créer un réseau maillé permettant une séparation des produits de PCR. Les fragments les plus légers migreront le plus loin. Le pourcentage élevé de 4% pour l'agarose permet une haute résolution (réseau

est déposé dans chaque puits ainsi qu’un marqueur de taille. Gel d’agarose 1% Tampon TAE (1X) 3 Les résultats de l’électrophorèse sont les suivants : Marqueur de taille T – témoin négatif sans ADNc ADNc 1000bp/100ng Figure 3 : Electrophorèse de la purification d’ADNc Le marqueur de taille (smart loader) permet généralement de faire une droite de régression et ainsi en reportant la distance à laquelle a migré l’échantillon de connaître sa taille. Or, ici, nous avons déjà estimé grâce

Principe 5.5 Protocole expérimental 5.6 Migration électrophorétique sur gel d’agarose 5 Réaction de polymérisation en chaine (PCR) 6.7 Principe 6.8 Protocole expérimental 6 Identification du produit de PCR par électrophorèse sur gel d’agarose 7.9 Principe 7.10 Mode opératoire de l’électrophorèse 7.11.3 Gel d’agarose à 2 % 7.11.4 Préparation de l’échantillon et migration électrophorétique 7.11 Interprétation des résultats

gène impliqué à calculer une probabilité Diagnostiquer grâce aux biotechnologies : à la drépanocytose : PCR + enzyme de restriction + électrophorèse à la mucoviscidose : dénaturation + réassociation de brins d'ADN PCR + dénaturation + sonde radioactive + autoradiographie à la myopathie de Duchenne : PCR + électrophorèse ou enzyme de restriction + sonde radioactive b-d'une anomalie chromosomique : ex : la

composée de CuSO4, EDTA disodique et de KCl. Elle se fixe sur les molécules, en formant un complexe coloré, et permet ainsi de mesurer la concentration de la substance. La structure du complexe formé est la suivante : On a ensuite réalisé une électrophorèse avec les fractions les plus concentrées où il n’y a pas eu de biuret ajouté pour chaque type de solution obtenu. On ne peut pas prendre les tubes ayant reçu du biuret car celui-ci dégrade les protéines, on choisit donc les tubes les plus concentrés

......... 54 2. Conditions d’expression................................................................................. 55 3. Techniques de biochimie...................................................................................... 57 A. Electrophorèse de protéines sur gel de polyacrylamide..................................... 57 1. Préparation des échantillons protéiques......................................................... 57 2. Préparation des gels de polyacrylamide et conditions de migration

(tampon). But Le but de cette manipulation est l'extraction de l'albumine du sérum par chromatographie d'affinité puis de la doser par spéctrophotométrie. Enfin nous contrôlerons la bonne séparation de l'albumine des autres protéines sériques par électrophorèse. Principes Plusieurs méthodes d'analyse et d'extraction ont été utilisées pour cette manipulation. Voici présenté le fonctionnement de ces différentes méthodes • Chromatographie d'affinité La chromatographie d'affinité permet l'adsorption

H2N-Arg-Val-Tyr Ile-His-Pro-Phe-COOH Séquence précise de l’angiotensine III H2NArg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-COOH angiotensinogène → angiotensine I → angiotensine II → angiotensine III 13. Electrophorèse et chromatographie des peptides A savoir Valeurs de pK d’ionisation des acides aminés 14 A) Electrophorèse (a) pK2= 8,95 pK1= 2,34 +NH Lys-Gly-Ala—GlyCOOH 3 +R PH pH pH pH 1,9; 2 charge +, (c, -) 3; > 1 +, (c) 6,5; ∼1 charge +, (c) 10; ∼ -, (a, +) PH pH pH pH

d’affinité b- Chromatographie d’exclusion II / Etude des fractions purifiées p.7 1) Méthodes p.7 2) Résultats et discussion p.8 a – Détermination des concentrations en protéines b- Suivi de la purification III / Electrophorèse p.11 1) Méthodes p.11 2) Résultats et discussion p.13 IV / Etude cinétique p.14 1) Méthodes p.14 2) Résultats et discussion p.15 Conclusion p.18 Introduction La Lactate Déshydrogénase (LDH), est une enzyme importante dans la régulation