Southern blot

2. Trypsination des cellules: 11 3. Transfection: 11 4. Immunofluorescence 12 5. Techniques de manipulation de protéines 13 a. La lyse cellulaire 13 b. Électrophorèse SDS-PAGE et immunodétection des protéines (western blot) 13 VI- Résultats : 14 1- Co-localisation de la p86-AmotL1 et la myosine : 14 2- Co-localisation de la p86-AmotL-1 et le Actine F : 16 3- Effet la surexpression de la p86-AmotL-1 sur le patron de la Actine F : 17 VII- Discussion :

Électrophorèse de protéines et immuno-révélation But Le but du TP est de vérifier la pureté du lysozyme purifié à partir de blanc d’œuf par chromatographie. Pour cela, deux techniques d’électrophorèse ont été utilisées : SDS-PAGE et Western Blot Principe Au cours de ce TP, nous avons utilisé plusieurs méthodes d’analyse de la pureté d’une fraction. Électrophorèse : Généralités L’électrophorèse est une technique analytique basée sur le déplacement de particules chargées dans un

La technique ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) est une technique immuno-enzymatique de détection qui permet de visualiser une réaction entre un antigène et un anticorps grâce à une réaction colorée produite par l'action sur un substrat d'une enzyme préalablement fixée à l'anticorps. C'est un test très utilisé en immunologie pour détecter la présence d'un anticorps ou d'un antigène dans un échantillon. Elle comprend plusieurs méthodes : La méthode directe du test ELISA qui consiste

l'ADN en biologie moléculaire. On peut utiliser la spectromètrie à 260 nm. Une autre technique fiable permettant la quantification de l'expression d'un gène est le Northern blot. Cette technique a été développée historiquement en utilisant l'hybridation de sondes radioactives ou fluorescente sur l'ADN amplifié. Le Northern blot nécessite des sondes radioactives, ce qui pose problème du point de vue de la sécurité (radioactivité) et du temps d'exposition des films radiographiques (long). La PCR

autre protéine. C°) Immuno-révélation Nous procédons ensuite à la révélation par coloration au Rouge Ponceau dans un premier temps qui est un colorant réversible & spécifique des protéines, puis par immuno-révélation, appelée également ≪ Western blot ≫. Notons que cette étape de révélation se fait après avoir préalablement saturé la membrane de nitrocellulose avec du TBS tween (tampon détergent) afin d’éviter les interactions non spécifiques. Le TBS lait permet ensuite de bloquer les sites libres

Activité : à partir des fractions Fn, Fm, vérifier la pureté des fractions par électrophorèse (SDS-PAGE, …), suivi d’un Western-blot/révélatioon par kit ECL+ … - Détailler la méthode : choix, principe, conditions électrophorétiques, conditions de blotting, anticorps utilisés, description du kit ECL (chimioluminescence) … - Résultats : électrophorégrammes, western-blot … - Synthèse : quelle fraction semble la plus pure ? - Conclusion/discussion à la partie scientifique : synthèse de l’ensemble

....................................................................................... 28 6. Morphométrie............................................................................................................................... 28 7. Western blot ................................................................................................................................. 29 7.1 Extraction protéique .........................................................................................

WESTERN BLOT PRINCIPES : Un western blot, ou immunoblot, est une méthode de biologie moléculaire qui permet la détection de protéines spécifiques sur une membrane. La technique se déroule en plusieurs étapes : des échantillons protéiques sont déposés sur un gel d’électrophorèse et sont séparés en fonction de leur poids moléculaire. Pour cela, un courant électrique est appliqué dans le gel. Plus les protéines ont une taille importante, moins elles migrent vite ; une fois que les protéines

différentes conditions de culture cellulaire. Deux techniques sont utilisées pour étudier la voies de MAP kinase : le Western Blot (une technique quantitative) pour montrer la présence ou non de Erk phosphorylé ou déphosphorylé et l’immunocytochimie (technique qualitative) pour mettre en évidence de Erk phosphorylé ou non dans la cellule. Matériel et méthodes 1) Western Blot a) Traitement des cellules Les cellules NIH3T3 ont été cultivées 24h en présence de DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)

R- est une lignée de cellules fibroblastiques n’exprimant pas IGF-1R mais possédant ERα et ERβ. La lignée cellulaire L6 (myoblastes) exprime l’ensemble des trois récepteurs étudiés. L’expression des différents récepteurs a été confirmée par Western blot. Inhibiteurs utilisés. H 1356 est un peptide analogue à IGF-1, c’est un antagoniste à IGF-1R. ICI 182,780 est un antagoniste aux récepteurs aux oestrogènes, inhibant aussi bien ER( que ER(. PD 98059 est un inhibiteur de la MAPKK. Résultats :