Violet de gentiane

d'une membrane externe supplémentaire. L’observation se fait au microscope optique à l’objectif x100 avec de l’huile à immersion. Principe des réactions biochimiques Le violet de gentiane traverse la paroi et les membranes des bactéries puis colore le cytoplasme. Le Lugol provoque une combinaison chimique entre le violet de gentiane et les composants cytoplasmiques des bactéries et fixe ainsi la coloration dans le cytoplasme. L’alcool traverse uniquement la paroi des bactéries gram – et décolore le

difficile à observer. Nous effectuons une coloration de Gram, colorant les bactéries Gram + en violet et les bactéries Gram – en rose par l’utilisation de plusieurs colorants et une différenciation à l’alcool-acétone au cours de la coloration. Les bactéries Gram + ont une paroi plus riche en peptidoglycane que la paroi d’une bactérie Gram – qui possède en plus une membrane externe. Le violet de gentiane colore toutes les bactéries et le lugol fixe ça. Intervient alors la différenciation, avec l’alcool

afin de différencier et de classer les bactéries éventuellement présentes. 1) Préparation : - Frottis préalablement fixé sur lame ; - Recouvrir complètement la lame de violet de gentiane, puis laisser agir pendant tente (30) secondes ; - Une fois le délai écoulé, chasser le violet de gentiane avec du Lugol en recouvrant complètement la lame. Laisser agir pendant trente (30) secondes ; - Egoutter la solution et rincer à l’eau du robinet ; - Verser de l’alcool sur le

par leur aptitude à fixer le violet de gentiane (Gram +) ou la fuschine (couleur rose) (Gram -). Son avantage est de donner une information rapide sur les bactéries présentes dans un produit ou un milieu tant sur le type que sur la forme. Mode opératoire : y y y y y y y y y y y Réaliser un frottis ou un étalement Fixer la préparation à la flamme, sécher soigneusement puis laisser refroidir la lame. Immerger les lames dans la solution de Violet de Gentiane pendant 1mm. Lavage à l'eau

des filtrats - Eliminer le milieu de culture - Rincer avec 200 ml de PBS - Eliminer le PBS - Perméabiliser 5 min avec 80 ml de méthanol - Eliminer le méthanol et laisser sécher sous hotte - Mettre en contact 5 min avec 50 ml de cristal violet à 0.1% - Vider, rincer à l’eau distiller jusqu’à obtention d’une eau claire et laisser sécher - solubiliser dans 100 ml de déoxycholate de sodium à 2 % - Lire l’absorbance à 600 nm. II.2.1.c. Exploitation des résultats Les filtrats potentiellement

que « le hasard ne favorise que les esprits préparés » comme aimait à le rappeler Pasteur. Dans une note de son article du 15 mars 1884 (Fig.1) pour “Fortschritte der Medicin”, HCJ Gram rapporte que des préparations colorées à l’aniline et au violet de gentiane sont totalement et rapidement décolorées par l’alcool après avoir été traitées avec de l’iode et de l’iodure de potassium. HCJ Gram ajoute : “j’avais essayé de faire une coloration double : sur des tissus de reins et sur des cylindres urinaires”

Réalisation d’un frottis – Dépôt des bactéries sur la lame Réalisation d’un frottis – Séchage du frottis Réalisation d’un frottis – Fixation à l’alcool Réalisation d’un frottis – Flambage à l’alcool Coloration de GRAM – Coloration au violet de gentiane Coloration de GRAM – Mordançage au lugol Coloration de GRAM – Décoloration à l’alcool Coloration de GRAM – Coloration à fuchsine Coloration de GRAM – Séchage de la coloration V Manipulations : Premier jour 1) Prélèvement

bactéries lactose + • Colonies bleu-violet : bactéries lactose – 4.2. Dénombrement Comparer la densité des colonies présentes sur la gélose CLED avec la série de reproductions étalons ci-contre correspondant à : 103, 104, 105, 106 et 107 bactéries/mL d’urine C. LARCHER Stries serrées perpendiculaire à la 1ère strie 3-Fiche CLED_Mac Conkey – Page 1 / 2 – GÉLOSES MAC CONKEY Il existe deux types de géloses Mac Conkey contenant ou non du cristal violet. 1. Contexte d’utilisation La gélose

lame entièrement séchée, la passer à la lame bleue du bec bunsen rapidement plusieurs fois pour fixer la préparation. Mode opératoire de la coloration: -Déposer quelque gouttes de cristal violet sur la préparation, laisser agir 30 secondes. -Déposer quelque gouttes de lugol sur le cristal violet, laisser agir 30 secondes. -Nettoyer la préparation à l'éthanol jusqu'à ce que le filet d'éthanol qui s'écoule de la lame soit transparent. -Rincer à l'eau. -Déposer quelque goutes de safranine

que le fil devienne rouge) Laisser sécher à l’Air (5-15 min), près de la Fixer votre frottis à la chaleur (3-4) fois à la flamme). Faire la coloration voulue. 1 :déposer votre lame sur le support prévueà cet effet 2 : couvrir la lame de cristal violet pendant 1 min 3 : Laver sous un filet d’eau 4 : recouvrir de lugol ( 1min) 5 : égoutter 6 :décoloration a alcool 95% inclinez votre lame et laissez couler lalcool gtts a gtts sur la lame jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de perte de coloration (5 a 15