Électrophorèse sur gel d'agarose

un plasmide pbluescript. Nous avons pu voir au cour du TP comment utiliser les techniques de clonage moléculaire via un vecteur, la digestion enzymatique avec les enzyme EcoR1 et Hind III, la transgenèse par choc thermique, l'électrophorèse sur gel d'agarose, et la minipréparation a l'aide du kit d'extraction de plasmide. Les résultat de cette expérience n'ont pas était très concluant pour ma part du fait de la sensibilité des différent dosage. En effet mes boites de pétri renfermait que 2 à 3 colonies

plasmidique précipite. En effet, ces différents alcools mobilisent l'eau du milieu, ce qui diminue la solubilité de l'ADN. Ainsi, Les charges négatives portées par les phosphates de l'ADN sont neutralisées par les ions potassium 4) Digestion et électrophorèse d’adn Dans cette étape nous avons cherchés à vérifier la taille du fragment d’ADN inséré dans le plasmide vecteur Pcr2.1. Pour cela on ajoute à l’ADN plasmidique du tampon d’hydrolyse 10x et une enzyme de restriction. Ici, l’enzyme est EcoRI

mettre en place la digestion d’ADN plasmidiques issus de deux clones différents, par différentes enzymes de restriction et ainsi pouvoir déterminer si le clonage a réussi. Pour cela, nous allons réaliser la digestion de l’ADN puis effectuer une électrophorèse. Matériel et méthodes : Pour faire ce tp, nous allons utiliser des ADN plasmidiques issu de deux clones différents pUC-L1 et pUC-L2 fournis en solution à 0,5 µg d’ADN/µl. Nous allons également utiliser deux enzymes de restriction, soit

pGEX + RNase * pGEX + EcoRI * pGEX + RNase + EcoRI * pGEX-IDH + RNase * pGEX-IDH + RNase + EcoRI * pGEX-IDH + RNase + EcoRI + BamHI * Electrophorèse horizontale en gel d’agarose : L’ADN plasmidique est chargé négativement : entraîné par un champ électrique, il migre vers l’anode (pôle positif). Le gel d’agarose constitue un réseau de mailles permettant de séparer des composés en fonction de leur taille ; la fourchette de séparation dépend de la concentration en agarose

quotidiennement (l'insuline par exemple, utilisée par de nombreuses personnes). Pour réaliser ce clonage moléculaire nous avons réalisés plusieurs étapes importantes telles que la digestion enzymatique, insertion dans un vecteur de clonage (plasmide), électrophorèse, extraction de l'ADN,... Introduction : Le clonage est la multiplication en grand nombre d'un gène, d'un organise ou d'une cellule souche. Il est très important de nos jours, en effet il nous permet d'obtenir en grande quantité un gène

TP : Recherche d’allèles mutés pour la mucoviscidose à l’aide d’une électrophorèse d’ADN La mucoviscidose est une pathologie génétique sévère, qui se traduit par une augmentation de la viscosité des sécrétions corporelles, elle atteint particulièrement les voies respiratoires et digestives. En cause, des mutations, plus de 2000 répertoriées qui altèrent le fonctionnement du gène CFTR affectant la synthèse de la protéine transmembranaire CFTR. L’objectif

(à 280nm)= 0.039 pour les protéines. Rapport = 1.789 Concentration = 0.071x 50 = 3.55 μg/ml Troisième Séance : Eléctrophorèse Sur Gel • Principe : Les protéines sont séparées en fonction de leur masse molaire par électrophorèse en présence de SDS sur gel de polyacrylamide de concentration uniforme dans un système à cuves verticales. • Methodologie : La Préparation du gel D’agarose à 1% : (1g agarose/ 100ml TBE ). TBE: tampon d’éléctrophorèse(Tris-borate-EDTA) Utilisé pour la migration éléctrophorique

la piste 3, confirmant que le gène possédait bien 800 paires de bases à l’origine, et de la piste 3d, démontrant 2 brins digérés, l’un de 600 paires de bases et l’autre de 150, résultats observés sur le gel d’agarose, qu’un troisième brin constitué de 50 paires de bases devait être tombé hors du gel et donc que ce brin d’ADN possédait 2 sites de restriction tout comme la mouche aux yeux blancs (Brassard,

(alourdisseur), de l’EDTA (neutralisation des DNases), ainsi que du bleu de bromophénol et du bleu de xylène de cyanol, marqueurs de suivi de la migration. I.2- Electrophorèse horizontale en gel d’agarose L’ADN plasmidique est chargé négativement : entraîné par un champ électrique, il migre vers l’anode (pôle positif). Le gel d’agarose constitue un réseau de mailles permettant de séparer des composés en fonction de leur taille ; la fourchette de séparation dépend de la concentration en agarose

amplification de entD par pcr 1.1.1. LYSE CELLULAIRE AUX MICROONDES1.1.2. realisation de la PCR1.1.3. Purification de l’amplicon 1.1.4 VISUALISATION et QuantifIcAtion de l’amplicon PAR Electrophorèse SUR GEL D'AGAROSE. 1.2. Insertion de l’amplicon DANS pCR 2.1-TOPO 1.3. - TRANSFORMATION de Escherichia coli TOP10 1.3.1 - PREPARATION DES CELLULES COMPETENTES. 1.3.2 - REALISATION DE LA