Électrophorèse sur gel d'agarose

 TP de Biologie Moléculaire Séparation d’ADN par électrophorèse analytique et préparative Objectif L’objectif de ce TP est de préparer et d’extraire l’ADN plasmidique pUC18-wzc à partir d’une souche d’E.coli pour établir une carte de restriction, puis de réaliser une électrophorèse en gel d’agarose afin d’isoler le fragment Eco RI/ Bam HI (wzc). Principe Préparation de l’ADN plasmidique La préparation de l’ADN plasmidique est réalisée à partir d’une souche d’E.coli cultivée à

caractéristique appelée site de restriction. Chaque enzyme de restriction reconnait ainsi un site spécifique. Egalement on fait agir une Dnase et une Rnase toujours sur cet ADN extrait. Et ces ADN extraits traités différemment sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose, on analyse la présence et la taille des acides nucléiques contenus dans la préparation, mais on détermine également, où ont lieu les sites de restriction spécifique de l’enzyme utilisée. Ceux-ci sont révélés par le bromure d'éthidium

couleur contenant 10 μL de contrôles positifs (C) • 1 microtube marqué M contenant le Master Mix • 1 Micropipette de 20 μL• Embouts à micropipette de 20 μL• 1 Thermocycleur• 1 Chambre à électrophorèse• 1 Bloc d'alimentation• 1 erlenmeyer contenant de l’agarose liquide à 1 % et le marqueur fluorescent • 1 Lecteur de gel• Tampon d’électrophorèse TAE 0,25 X• 1 Bécher de 500 ml• 1 plat de plastique numéroté• Analyse génétique du chromosome 16S ( Biothechnologie) 12 mars 2022 15:09 CAHIER D'OBSERVATION

restriction. La digestion enzymatique se fait à 37°C pendant 1h30. Préparation du mix pour Rsal et Fokl: 5. Electrophorèse Elle se divise en deux parties : - la migration des ADN extraits et des produits de la PCR - la migration des produits de digestion enzymatiques Pour la première migration on prépare 60mL de gel à 1%. Pour ce faire, on pèse 0,6g d’agarose que l’on dilue dans 100 ml de TBE. Le tout est chauffé pour que la dilution soit totale. Après avoir laissé

inverse 5.4 Principe 5.5 Protocole expérimental 5.6 Migration électrophorétique sur gel d’agarose 5 Réaction de polymérisation en chaine (PCR) 6.7 Principe 6.8 Protocole expérimental 6 Identification du produit de PCR par électrophorèse sur gel d’agarose 7.9 Principe 7.10 Mode opératoire de l’électrophorèse 7.11.3 Gel d’agarose à 2 % 7.11.4 Préparation de l’échantillon et migration électrophorétique 7.11 Interprétation

séparés en gel d'agarose ou, si les fragments sont de petite taille, en gel de polyacrylamide. • Après dénaturation de l'ADN et transfert par capillarité ou par électrophorèse, sur des filtres de nitrocellulose ou de nylon à l’aide de la sonde spécifique l’ADN sera détecté. 1 - Après avoir digéré l'ADN à étudier par une enzyme de restriction, on obtient un mélange de très nombreux fragments de restriction. On soumet ces fragments à une électrophorèse pour les faire migrer dans un gel de haut

fragments d'ADN lambda clonés. RESULTATS ET DISCUSSION Analyse par électrophorèse de fragments d'ADN: Le TP de bio 57 est composé de deux analyses par électrophorèse sur gel d'agarose. L'électrophorèse en gel est utilisée pour séparer les macromolécules biologiques en fonction de leurs tailles et de leurs charges électriques. Le gel est constitué d'une matrice de polymère baignant dans un tampon conducteur. Sur ce gel les fragments de plus petites tailles se retrouvent le plus loin du puits

Au cours du TP, une partie de l’ADN extrait va subir divers traitements comme l’hydrolyse par une enzyme de restriction, le traitement avec la RNase et la DNase I. Puis chacun de ces traitements sera ensuite déposé puis analysé par électrophorèse sur gel d’agarose. Ils seront révélés par le bromure d’éthidium qui est un colorant et dont la fluorescence augmente en présence d’ADN. Grâce à cette technique, la présence et la taille des acides nucléiques va pouvoir être étudiée, ainsi que la localisation

l'ADN obtenu peut-être insuffisant pour continuer son analyse.De plus, cette ADN peut être dégradé ou abimé par le temps. C'est pour ces raisons, que nous allons amplifier l'ADN obtenu par une méthode dite PCR. III. La méthode PCR et Electrophorèse A. PCR La réaction en chaîne par polymérase (PCR est l'abréviation anglaise de Polymerase Chain Reaction) va permettre de récupérer une très grande quantité d’ADN avec un échantillon d’ADN très faible, qu’il soit dégradé ou même ancien

Intérêt de la PCR et conditions opératoires 3. Réactions enzymatiques : restriction et ligation 4. Electrophorèse en gel d’agarose a) Migration/Séparation b) Conditions opératoires c) Visualisation d) Purification III. Résultats et discussion 1. Gel 1 2. Gel 2 B. Transformation bactérienne I. principes 1. la chimiocompétence 2. l’électroperméabilisation