Taq polymérase

l'équivalent de 9 échantillons. L'ADN polymérase utilisée est une TAQ polymérase hot-start. Les TAQ polymérases peuvent résister à de hautes températures, nécessaire au fonctionnement du processus de PCR. Afin de s'assurer que les PCR de tout les binômes démarrent en même temps, la TAQ polymérase hot-start est inactive à température ambiante (présence d'un anticorps ou d'un composé chimique inhibant sa fonction). Ainsi, une étape d'activation de la TAQ polymérase hot-start à 95°C pendant 15 minutes

la quantité d’ADN prélevée est trop faible, on réalise alors une réaction en chaine par polymérase (PCR). 3- La PCR, technique de réplication de l’ADN La PCR ( Polymerase Chain Reaction ) ou réaction en chaine par polymérase est une technique de réplication d’un fragment d’ADN particulier dont la séquence est au moins partiellement connue. Pour cela, on réalise une réplication enzymatique. La polymérase est une enzyme capable d'assembler des nucléotides, formant ainsi un brin d'ADN complémentaire

certaines enquêtes policières, la quantité d'ADN prélevée qui permettrait d'identifier un suspect est parfois trop faible pour être analysée (quelques gouttes de sang, de sperme, etc.) Il faut donc amplifier cet ADN. Cela est possible grâce à la PCR (Polymerase Chain reaction), une technique basée sur la connaissance des mécanismes de réplication de l'ADN. Problématique : On recherche à comprendre quel mécanisme permet de doubler la quantité d'ADN de la cellule avant chaque division.

de tampon 10X MgCl2 (1 mM), 2,5 µl de chaque amorce (2 µM), 0,125 µl de dNTP (100 µM), 0,25 µl de Taq polymérase (Roche Applied Science, Meylan, France), eau qsp 25µl et 2 µl d’ADN génomique. Pour les PCR SHV, les réactions d’amplification ont été réalisées dans des mix de 50 µl, contenant 5 µl de tampon 10X MgCl2 (15mM), 5 µl de chaque amorce (2 µM), 0,25 µl de dNTP (100 µM), 0,5 µl de Taq polymérase et 4 µl d’ADN génomique. Les séquences des amorces utilisées et leur Tm sont indiqués dans le Tableau

dégrader l'ADN dans sens 5'-3' au niveau de ces coupures et repolymériser en présence d'un nucléotide chaud. L’ADN double brin traité par la DNAse I est clivé au hasard. La réparation des coupures réalisées par la DnAse I nécessite l'action de l'ADN polymérase I en présence de désoxynucléosides triphosphates marqués au phosphore radioactif (32P). Les désoxynucléosides triphosphates utilisés sont marqués en position alpha au 32P. -Random- priming ou marquage par amorçage au hasard Chauffage suivi d'un

coupé par l’enzyme de restriction, le fragment marqué sera donc plus long. 1.4.6 Autres enzymes : polymérase d’AN 1.4.6.1 Transcriptase inverse : rétro transcriptase Enzyme extraites de rétrovirus (virus à ARN) En pratique, cette enzyme est utilisée chaque fois qu’il est nécessaire de transcrire l’ARN en cADN Comme toutes les polymérases, cette enzyme travaille dans le sens 5’->3’ 1.4.6.2 ADN polymérase I Enzyme d’origine bactérienne (extraite à partir de E coli) Avec une activité polymérasique sens

une dénaturation de l'ADN par chauffage à 95°C pour séparer les deux brins, une hybridation des amorces aux extrémités de la séquence recherchée, puis une élongation des brins d’ADN grâce à l'action d'une ADN polymérase : la Taq polymérase à partir des deux amorces. Ce cycle est répété un grand nombre de fois (30 fois) pour obtenir une multiplication exponentielle de la séquence d'ADN cible. Préparation d’un mix PCR pour chaque couple d’amorce

détermination des séquences génomiques des Organismes importants 2-La PCR (Polymerase Chain Reaction) : ACP= Amplification en Chaîne par Polymérase Principe : *Succession de réplication d’une molécule d’ADN db ciblé (Millions de fragments précis/heure) *3ème cycle : la quantité initiale d’ADN x 8 *La PCR a lieu dans un petit tube installé dans un thermocycleur. Contenu du tube : ADN cible , Les oligonucléotides, Taq poly ,bases azotées 3- Les puces d’ADN; Outil technologique qui sert

PCR de couleur contenant 10 μL de contrôles positifs (C) (#3, 4 et 5)• C+/+ (Allèles +/+ (rose)) C-/- (Allèles -/- (vert)) C +/- (Allèles +/- (jaune)) 1 microtube marqué M contenant le Master Mix (tampon, dNTPs, amorces, Taq polymérase) • Positionner les tubes vissés et les nouveaux tubes sur le portoir comme suit :1. Tableau 1 Disposition des tubes de PCR pour une table complète (2 équipes, 1 support par équipe) Équipe 1

l’ADN polymérase utilisée. Cette dernière est une TAQ Hot Start. Il s’agit d’une ADN polymérase qui peut fonctionner à hautes températures ce qui est possible dans la mesure où elle est extraite d’une bactérie résistante à la chaleur qui vit dans des sources d’eau chaude. Par ailleurs, pour éviter les pertes d’activité, nous souhaitons que l’enzyme commence à fonctionner en même temps pour tous les binômes. C’est pourquoi un groupement chimique ou un anticorps a été au préalable ajouté à la TAQ Hot