Glutathion

Expression et purification d’une protéine fusionnée à la Glutathion-S-transférase Objectif : Obtention de l’enzyme Isocitrate déshydrogénase (IDH) par purification et clivage de la protéine de fusion Glutathion-S-transférase-Isocitrate déshydrogénase (GST-IDH), exprimée par le plasmide pGEX-IDH dans la souche transformée E. coli JM103/pGEX-IDH, avec pGEX est en réalité pGEX-2T. I. Détermination de la taille de l’insert IDH I.1- Construction du plasmide pGEX-IDH L’insertion/ligation du fragment

cytochrome P450 (notamment l’iso forme CYP 2E1) en un intermédiaire N-hydroxyparacétamol, donnant lui-même une quinone-imine extrêmement toxique que l’on nomme la N-acétyl-p-benzoquinone-imine ( noté NAPQI).Cette NAPQI est normalement inactivée par le glutathion réduit puis est éliminé par excrétion rénale. http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1624069307001570-gr3.jpg Son mode d’action Malgré son ancienneté, le mécanisme d’action précis du paracétamol

ne possede pas de transgène ou il n’est pas exprimé. Induction 1. Introduction Cette experience est sacrifiée à l’étude l’induction d’expression bacterienne. La protéine p53 est produite par E. Coli sous forme d’une fusion avec la GST (Glutathion S Transférase). Fragment de l’ADN codant pour la protéine de fusion se trouve sous contrôle du promoteur Ptac. L'expression de gènes en amont de ce promoteur est réprimée par la protéine LacI. L’ajout de l'inductuer comme IPTG inactive le répresseur

On utilise comme système d’expression E.coli (souche JM109) transformé par le plasmide pGEX-2T dans lequel on a inséré le gène de l’IDH. L’IDH recombinante exprimée est en fusion avec la glutathion-S-transférase (GST) à des fins de purification par chromatographie d’affinité sur une colonne glutathione sepharose 4B. L’IDH peut être étudiée et dosée après clivage de la protéine de fusion par la thrombine. II- Principes III- Interprétations des résultats Culture On réalise 30 mL de

1. Principal système de défense non enzymatique : Le glutathion Le glutathion est un thiol très abondant se retrouvant de façon ubiquitaire chez les animaux et les végétaux. Il possède deux formes redox distinctes. La forme réduite (GSH) est un tri-peptide stable, à fort pouvoir réducteur et très soluble dans l’eau. Toutes ces caractéristiques en font un donneur d’électrons adéquat dans les réactions physiologiques. L’oxydation du glutathion entraîne la formation d’un pont disulfure entre les cystéines

sous la langue toutes les 2/3 heures · Vitamine D3 : 10 000 UI par jour · Zinc bisglycinate : 10 mg 2 fois par jour · Glutathion liposomal : 1 dose sous la langue toutes les 2/3 heures · MgCl2 Sels de Nigari chez NR&D  : 3 fois 1 gélule par jour loin de tout fer · ou 1 c. à café par jour dans 1/2 verre

comprendre les mécanismes sous-jacents. Ainsi, l’effet de différentes concentrations d’activateurs Anti-CD3 et Concanavaline A (ConA) sur la transformation blastique des lymphocytes T a été mesuré dans des milieux contenant différentes concentrations de glutathion (GSH) et de diéthylmaléate (DEM). De même, les effets de l’immunosuppresseur Cyclosporine A(CyA) sur l’activation des lymphocytes T ont également été mesurés. Les mesures ont été effectuées par rapport à l’activité métabolique des cellules grâce

(glycosides, glutathion ou acides aminés), ce qui en favorise l’excrétion. Dans le cas des insecticides, cette métabolisation se traduit souvent par une perte d’activité des produits avec développement de phénomènes de résistance. Trois types d’enzymes participent à ce processus : les cytochromes P-450 qui introduisent un atome d’oxygène dans leurs substrats ; les glutathion Stransférases qui catalysent la conjugaison de molécules ayant un centre électrophile avec le groupement thiol du glutathion et enfin

Cytochrome p450 (plus précisément par les isoenzymes CYP2E1, CYP1A2, CYP3A4)[31], qui aboutit à la formation d'un intermédiaire réactif toxique, la N-acétyl p-benzoquinone imine ou NAPQI. Il est normalement rapidement éliminé par réaction avec le glutathion réduit puis évacué dans les urines après conjugaison à la cystéine et à l'acide mercaptopurique. L'élimination du paracétamol est essentiellement urinaire : 90 % de la dose ingérée est éliminée par le rein en 24 heures, principalement sous forme

semicarbazide : 2,2M Chlorhydrate de semicarbazide (5 g) NaOH 2M (20 ml) Ajuster à pH 6,3-6,5 (viser la valeur 6,4 au pHmètre) avec NaOH 5M. b) Solution de NAD+ : Dissoudre NAD+ dans de l'eau distillée : 20 mg/ml. c) Solution de glutathion : 300mM Glutathion dans de l'eau distillée : 90 mg/ml. d) Solution d'albumine : Albumine dans de l'eau distillée : 100 mg/100 ml. 4° - Solution enzymatique à utiliser pour les expériences : 1 ml de la solution mère d'enzyme ajouté à 200 ml de la solution