Ligase

coupure par enzyme de restriction sur un plasmide, car un plasmide coupé en deux endroits donnerait deux fragments et ne serait donc plus utilisable pour le clonage. L’insertion du fragment d’ADN au plasmide nécessite une enzyme particulière, la ligase. La ligase est une enzyme qui est capable de lier de façon covalente deux molécules d’ADN ayant des extrémités compatibles en une. Cette ligation nécessite l’inactivation des enzymes de restriction. Il est possible de fragmenter le génome entier d’un organisme

de deux types et seule la topo-isomérase de types II consomme de l’ATP. La topo-isomérase de type II d’E-Coli s’appelle l’ADN-gyrase. • Les ADN ligases (ou DNA G) catalyse la formation de la liaison phosphodiester, mais est bincapable de placer les nucléotides. Lors de réparation de l’ADN les nucléotides en place ne sont plus triphosphatés, ADN ligase à donc besoin d’un apport en ATP. b/ l’Origines et terminaisons chez E-Coli L’origine de réplication possède une séquence répétée de 13 pdb riche

sécher. Une fois secs, ils ont été repris dans 10µL d'eau stérile. Ligature des deux fragments Le principe au niveau de cette étape était de faire la ligation du plasmide et de l’insert. L’insert et le plasmide ont été mélangés avec l’enzyme ligase qui a créé la liaison phosphodiester entre les extrémités 5’ phosphate et 3’ OH des deux fragments. Le plasmide pBluescript ainsi refermé devenait recombinant. Pour réaliser cette ligature nous avons d’abord vérifié la présence de l’insert et du

plus intéressante. Ici, par utilisation de plasmide pBluescript nous souhaitions obtenir plusieurs clones d'une molécule d'ADN. Pour se faire, grâce aux enzymes de restriction EcoRI et Hind III, l'ADN et le plasmide furent digérés. Par l'emploi de ligase, nous pouvions effectuer la ligation des fragments d'ADN aux plasmides. Après transformation et culture des bactéries dans des boites de Pétri, les clones sélectionnés ont été analysé par électrophorèse sur gel d'agarose afin de vérifier la qualité

celles que nous avons développées précédemment. Elle se déroule en cinq étapes très précises. * 1ère étape :   On introduit, tout d’abord, le gène étranger dans un plasmide (ADN bactérien). On utilise pour cela différentes enzymes, notamment la ligase ou une enzyme de restriction qui agit de la même maniè-re. Sous son action, l’ADN est incorporé dans le plasmide lui conférant ainsi de nouvelles caractéristi-ques. C’est alors que l’on obtient un plasmide génétiquement modifié comprenant le gène

sur lui-même (Figure 2). Figure 2 : Digestion enzymatique et déphosphorylation du plasmide Après dénaturation de la phosphatase par la chaleur il faut refermer notre plasmide. La fermeture du plasmide se fait avec une enzyme de la famille des ligases. Notre plasmide est désormais près, il faut maintenant l’amplifier. Pour y parvenir nous allons faire une transformation bactérienne, c’est-à-dire que grâce à une électroporation nous allons faire rentrer des plasmides dans des bactéries, ainsi

de terrain catalan a encore soif de titres et espère bien en accumuler quelques autres pour augmenter son avance dans ce classement. 20 avec le Barça, 3 avec la sélection Xavi compte huit titres différents. Son palmarès en club est exceptionnel : 6 Ligas, 3 Ligues des Champions, 2 Coupes du Roi, 2 Supercoupes d’Europe, 5 Supercoupes d’Espagne et 2 Mondiaux des clubs. Son curriculum avec la sélection espagnole est aussi impressionnant, avec deux Euros et un titre de champion du Monde. Il remporte même

de molécules d'ubiquitine par un système multienzymatiques E1, E2et E3 suivant les étapes suivantes : * L’enzyme E1 est activée par la fixation d'une molécule ubiquitine (Ub). * Puis transfère cette molécule d’Ub à E2 * L’Ubiquitine ligase E3 transfère la molécule d’Ub liés à E2 au -NH2 de la chaîne latérale d'un résidu lysine dans une protéine cible * D'autres molécules d'Ub sont ajoutés à la protéine cible en répétant les étapes précédentes formant une chaîne polyubiquitine qui

allons liés le fragment de phage au plasmide par ligation. La ligation permet l'établissement de liaison phosphodiester par une enzyme, appeler la ligase,entre le fragment de phage et le plasmides. Pour cette étape nous allons préparé 3 tubes avec de l'ADN de plasmides digéré précédemment, une solution tampon de ligation (10X) et de l'enzyme ligase (1units/µL). Les 3 tubes vont se différencier juste par la quantité d'ADN lambda digéré ajouté. Un des 3 tubes sera le témoins et ne comportera pas d'ADN

ne durent jamais, un été peut-être à bien compter, c’est tout » (p. 89). « Je voudrais donner Hélène Lagonelle à cet homme qui fait ça sur moi pour qu’il le fasse à son tour sur elle » (p. 92). Lire sur ce sujet le long article érudit de Pierluigi Ligas.   L’homosexualité masculine est évoquée brièvement dans la liste des délits commis par le frère aîné dans sa longue déchéance : « Après la mort de ma mère il est seul. Il n’a pas d’amis, il n’a jamais eu d’amis, il a eu quelquefois des femmes qu’il