Nucléase

29 5.30 Les nucléases Fragment de restriction (définition) Système de restriction-modification Nomenclature des enzymes de restriction Restriction (réaction générale) Tampons d’incubation (restriction) EcoR I EcoR V Pvu II Hae III Pvu I Pst I Kpn I Alphabet dégénéré Ava II Hind II Hga I Mbo II Hha I Hpa I Digestion d’une séquence (Hae III) Digestion d’une séquence (Mbo II) Ribonucléase A Ribonucléase T1 Ribonucléase H Désoxyribonucléase I Nucléase BAL 31 Nucléase S1 Nuclease de mung-bean Exonucléase

plus utilisées aujourd’hui pour extraire et purifier des acides nucléiques sont décrits dans les sections suivantes. Méthodes d’extraction L’extraction d’acides nucléiques d’un matériau biologique requiert la lyse cellulaire, l’inactivation des nucléases cellulaires et la séparation de l’acide nucléique souhaité de débris cellulaires. La procédure de lyse idéale est souvent un compromis de techniques et doit être suffisamment rigoureuse pour briser le matériau de départ complexe (par exemple, le

 protéine     3-­1-­Une  réparation  efficace   La  correction  de  la  synthèse  d’ADN  lors  de  la  réplication  est  effectuée  par  des  protéines   particulières  que  l’on  nomme  :  nucléases.  Elles  sont  associées  au  complexe  enzymatique  de  l’ADN   polymérase.   La  reconnaissance  des  erreurs  d’appariements  est  essentiellement  géométrique.  La  synthèse  de  la   molécule  d’ADN

(ADNc) par une transcriptase inverse. 1. 1. Préparation d'une banque d'ADN à l'aide d'enzymes de restriction : banque d'ADN génomique. Préparation de l'ADN. Les enzymes de restriction (voir polycopié introduction au génie génétique) sont des nucléasse purifiées à partir de bactéries qui coupent l'ADN au niveau de séquences spécifiques de 4 à 8 nucléotides, produisant des fragments d'ADN de tailles strictement définies, les fragments de restriction. Les enzymes de restriction sont utilisées pour

l’ARN : Par ses nucléosides : 2-déoxyribose / ribose (Ribonucléotides réductases) Par sa base : 5-méthyl Uracile (Thymine) / Uracile Formation des Déoxyribonucléotides Ribonucléotide Réductase Catabolisme des Ribonucléotides Puriques Nucléases Nucléases Nucléotidase Adénase Guanase Catabolisme des Ribonucléotides Puriques Xanthine Oxydase Anomalies du métabolisme des Purines Les Hyperuricémies Primaires: La Goutte La Maladie de Lesch-Nyhan Secondaires: insuffisance rénale, hémopathies

phospholipides des membranes. Dans le cas des cellules eucaryotes, le prélèvement de sang veineux au pli du coude est la technique la plus employée pour obtenir de l’ADN génomique. Le sang est recueilli sur EDTA, chélateur des ions divalents, cofacteurs des nucléases. Pour faciliter l’extraction de l’ADN, on isole du sang total un culot de cellules nucléées, les lymphocytes.Le sang est d’abord déposé en gradient de densité dans un tube à centrifuger, au-dessus d’une couche de polyfluorocarbone liquide (Ficoll

Incorporation d’un mauvais nucléotide (cf mauvais appariement) Blocage de l’élongation (pause) Activation d’une activité nucléase de l’ARN polymérase Elle corrige de 3’ vers 5’. Deux protéines facilitant la reconnaissance de l’extrémité 3’ du transcrit mal apparié au brin d’ADN matrice : GreA et GreB. Fixation sur l’ARN poly et contact avec l’ARN naissant Activation de ‘activité nucléase de l’ARN poly Clivage de 2-3 nucléotides (pour GreA) jusqu’à 18 nucléotides (pour GreB) Diapo 39 : La terminaison

Les ARN sont plus petite et moins stable que les ADN. Ils sont biochimiquement constitués de courtes séquences nucléotidiques de quatre bases ( A, U, G, C) et d'un ribose. Il y a de nombreuse enzyme qui dégradent ADN et ARN ce sont des nucléases. Ces nucléases peuvent êtres très spécifique: -pour l'ADN on parle de DNases -pour l'ARN on parle de RNases 4) Séquençage L'ARN n'est pas séquencé, c'est l'ADN qui peut l'être. Parfois on voudrait séquencer les ARNm, mais pour cela il doit être

structures cellulaires et éliminer les grosses molécules. On obtient un lysat. L’EDTA présent dans cette solution va permettre de protéger l’ADN d’intérêt contre la dégradation par les nucléases présentes en les rendant inactives, étant donné que ce composé est un chélateur de Mg 2+ et que le bon fonctionnement des nucléases nécessite des ions Mg2+. Ensuite nous mettons la solution 2 contenant le SDS et la soude (NaOH). Le SDS est un détergent qui dissous et dégrade les composants lipidiques de la membrane

molécule de marquage (biotine) à l’ARN. 1.4.8 Autres ENZYMES : nUCLéase 1.4.8.1 Dnase I Nucléase extraites du pâncréas bovin, coupant l’ADN après une pyrimidine (T, C) L’ADN digéré peut être simple brin ou double brin. Cette enzyme est utilisé dans : L’analyse des gènes actifs car elle coupe les pyrimidines localisées dans les parties d’ADN activement transcrite (gènes). Loa création de cassure pour le marquage des ADN. 1.4.8.2 Nucléase S1 Enzyme extraite d’un champignon dégradant spécifiquement