Chromatographie Sur Colonne

Applications de la Chromatographie d’ xclusion E Stérique à la caractérisation de systèmes macromoléculaires au sein de l’ unité mixte CNRS-bioMérieux CNRSCatherine Ladavière, Ladavière Bertrand de Lambert, Carole Chaix, Marie-Thérèse Charreyre, Thierry Delair, Christian Pichot Système macromoléculaire et Immuno-virologie Humaine UMR 2142 Ecole Normale Supérieure de Lyon 46, allée d'Italie 69364 Lyon http://www.ens-lyon.fr/CNRS-bioMerieux • A propos de Polymères… • Chromatographie d’ Exclusion

Chromatographie La chromatographie, est une technique physicochimique qui permet de séparer les constituants d’un mélange (les solutés) par l’intermédiaire d’une phase mobile (liquide ou gazeuse), le long d’une phase stationnaire (solide ou liquide fixé) grâce à la répartition sélective des solutés entre ces deux phases. Chaque soluté est donc soumis à une force de rétention (exercée par la phase stationnaire) et une force de mobilité (due à la phase mobile). Il existe différents types de chromatographies :

localisation, dans un peptide, du site d’interaction avec un glycosaminoglycane naturel : l’Héparine. Pour cela, on utilisera une méthode d’analyse et de purification : la chromatographie en phase inversée avec appariement d’ions en HPLC. PRINCIPE : * Chromatographie en phase inversée avec appariement d’ions : Dans la chromatographie en phase inversée, c’est la phase stationnaire, constituée souvent d’un hydrocarbure, qui est apolaire La phase mobile est un solvant polaire, tel l'eau, le méthanol

l’aide de la précipitation au BaCl2 te de la chromatographie échangeuse d’ions , la deuxième partie à pour but de tester la stabilité de la thrombine par dénaturation à l’urée et fluorométrie. Dans cette première partie, nous avons mis en évidence la forte présence de thrombine dans le plasma, puis après précipitation et centrifugation nous avons constaté la présence de thrombine dans les culots et son absence dans les surnageants. La chromatographie a permis de sélectionner, à partir de sang, une

(GC/MS), consiste à réunir la colonne capillaire et le spectromètre de masse, soit en introduisant directement l'extrémité de la colonne dans la chambre d'ionisation, soit par le relais d'un capillaire de transfert chauffé, placé entre le chromatographe et le spectromètre de masse. A condition que le débit dans la colonne ne dépasse pas quelques ml/min, et que les colonnes soient très longues, les pompes peuvent maintenir le vide nécessaire à l'analyse. Pour les colonnes à garnissage dont le débit

Exercices de chromatographie : Exercice 1 : On détermine les temps de rétention (tr) au cours d'une chromatographie sur Sephadex, des protéines suivantes dont on connaît la masse moléculaire (MM) (Le débit de la colonne est de 5 ml / min) : MM tr (min) Aldolase 145000 10,4 Lactate déshydrogénase 135000 11,4 Phosphatase alcaline 80000 18,4 Ovalbumine 45000 26,2 Lactoglobuline 37100 28,6 1 - Calculer les volumes d'élution (Ve) correspondants. Porter le log de MM en fonction de Ve - Que remarquez-vous

hypobromeux. L’acide hypobromeux et un meilleur agent de substitution que l’acide hypochloreux. Les THM sont analysés par chromatographie gazeuse avec detecteur par capture d’électrons (GC-ECD). - Les acides haloacétiques (AHA) : ce sont après les THM, la deuxième famille de SPD les plus courants. Le AHA majoritaire est l’acide dibromoacétique. Les AHA sont analysés par chromatographie gazeuse avec detecteur par capture d’électrons (GC-ECD). c) Les désinfectants - La chloramine :

incubation et cette dialyse nous permettent donc d'éliminer partiellement les acides nucléiques chargés négativement et les molécules de masse moléculaire inférieure à 12 000 Da (un nucléotide a une masse moléculaire de 330 Da). En effet, la chromatographie sur résine échangeuse d'ions est une technique de purification sur le critère de la charge, qui nous permet d'isoler partiellement la β-galactosidase des autres molécules de l'extrait bactérien. Or si on laisse l'ADN et les nucléotides qui sont

fois injecté dans le sang va clivée le facteur II en facteur IIa et provoquer une importante thrombose. Dans ce TP nous allons donc chercher à isoler (purifier) la prothrombine de deux manières différentes : par précipitation au BaCl2 et par chromatographie échangeuse d'ion . Nous allons ensuite essayer de déterminer l'activité enzymatique de la prothrombine transformé en thrombine, sous l'action de l'écarine et grâce à un substrat chromogénique. II. Matériel et méthodes : '' précipitations

prothrombine et pour cela 3 étapes sont nécessaires : précipitation au BaCl₂, dialyse et chromatographie échangeuse d’ions. La dialyse pouvant durer plusieurs jours, seules les 2 autres étapes vont être réalisées dans ce TP. Deux notions importantes vont être abordées, tout d’abord une notion de rendement puis une notion de taux de pureté à partir des étapes de précipitation au BaCl2 et de purification par chromatographie échangeuse d’ions. En effet durant la première étape de précipitation au BaCl2 une