Plasmide

première étape consiste à préparer du plasmide puis à incorporer plusieurs gènes provenant de tout organisme vivant, animal, bactérie ou plante. Lorsque les plasmide est prêt, on l'insère dans la bactérie. On cultive ensuite cette bactérie qui va se reproduire très rapidement pour former de nombreuses autres bactéries qui possèdent toutes le plasmide incorporé. Après le développement des bactéries, il faut isoler les plasmides clonés. Pour transférer les plasmides dans des cellules végétales, on peut

un plasmide, fragment d’ADN circulaire qui est utilisé comme vecteur pour transporter le gène d’intérêt dans les cellules de la plante à modifier. 4 – On insère ensuite le gène d’intérêt dans le plasmide. 5 – Le plasmide est introduit dans une autre bactérie. 6 – Des colonies des bactéries (E.coli) modifiés sont mises en culture. Ensuite les chercheurs ont le choix entre deux techniques. Par bombardement de microbilles de tungstène tungstè Par transfert de plasmides 1 – Les plasmides créés

expérimentalement. Le promoteur est cloné dans un plasmide contenant un gène rapporteur. A partir de ce premier plasmide recombinant, d’autres plasmides ont été construits. Ils portent des mutations d’éléments en cis présents dans le promoteur dénommés boîtes a et b. La figure ci-dessous montre la structure schématique du promoteur avec les éléments en cis. Les mutations des éléments en cis sont représentées par des croix. Les différents plasmides sont transfectés dans des cellules en culture qui

nécessaire quotidiennement (l'insuline par exemple, utilisée par de nombreuses personnes). Pour réaliser ce clonage moléculaire nous avons réalisés plusieurs étapes importantes telles que la digestion enzymatique, insertion dans un vecteur de clonage (plasmide), électrophorèse, extraction de l'ADN,... Introduction : Le clonage est la multiplication en grand nombre d'un gène, d'un organise ou d'une cellule souche. Il est très important de nos jours, en effet il nous permet d'obtenir en grande quantité

l’ADNc sera inséré dans un plasmide et pourra donc être transcrit in vitro en ARN qui sera utilisé comme sonde pour étudier l’expression du gène TAT. A A Souche ayant intégré le plasmide non recombinant, elle est résistante à l’ampicilline et possède, la partie NH2terminale au niveau du plasmide et C terminale au niveau de l’ADN bactérien, de la protéine βGalactosidase. Cette souche pourra dégrader le X-Gal en Gal+X(de couleur bleue) Souche ayant intégré le plasmide recombinant, elle est résistante

ont été réalisées pour tester cette hypothèse. -A) retard sur gel (figure 1). B) transfections (Figure 2). Le promoteur du gène PIGR contenant le motif E est inséré dans un plasmide en amont du gène de la luciférase (plasmide WT-PIGR). Le plasmide est co-transfecté dans des cellules intestinales avec un plasmide codant les facteurs USF ou MYC. 24h après transfection, l’activité luciférase est analysée (figure 2). -C) immuno-précipitation de chromatine (figure 3). Des cellules en culture

d’ADN étranger dans un vecteur -Digestion de l’ADN plasmidique -Déphosphorylation des extrémités 5’ du plasmide -Purification du fragment à intégrer -Ligation par une ligase + ATP -vérification par électrophorèse Clonage de bouts francs : + difficile Rendre les extrémités de l’insert et du plamide cohésives : + efficace 2 Il faut amplifier le vecteur recombinant c- du plasmide pBR 322 au phagemides, cosmides, BAC et YAC pBR 322 4000pb ; 1 origine de réplication ; 2 gènes de résistance

bactérie F- par conjugaison avec une bactérie F+ contenant un plasmide possédant le gène de la protéine kinase B. Production dans une bactérie Hfr contenant un plasmide d’expression C. Production dans une levure à partir d’un plasmide contenant un promoteur de levure D. Production dans une cellule procaryote infectée par un phage vecteur E. Production dans une souris infectée par un adénovirus contenant un plasmide d’expression Question N° 47 : Pour cloner des fragments

grande vitesse de prolifération de ces dernières pour reproduire à l'identique un très grand nombre de copies de ce fragment d'ADN. Pour cela, le fragment d'ADN est au préalable introduit dans une construction que l'on appelle vecteur ou plasmide. Ce plasmide est une molécule d'ADN circulaire qui permet à la fois d'introduire la séquence d'ADN à étudier dans le microorganisme récepteur mais aussi d'assurer le maintien de ce fragment d'ADN d'intérêt dans la cellule hôte de génération en génération

plasmidique. Un gel d’électrophorèse sur gel d’agarose à 1% est réalisé pour contrôler la préparation. Etablissement de la carte de restriction de pUC18-wzc Pour réaliser la carte de restriction du plasmide pUC18-wzc, on utilise plusieurs enzymes de restriction qui vont digérer le plasmide. Les six premiers tubes vont nous permettre d’établir cette carte, le tube 7 nous servira à purifier le fragment wzc. Dans ces deux cas on ajoute, après incubation, du BEG (Bleu EDTA Glycérol) qui va alourdir