Plasmide

Chapitre 3 : Transformation des bactéries avec l’ADN plasmide, purification et caractérisation de l’ADN plasmide Transformation des bactéries par l’ADN plasmide et purification de l’ADN plasmide Matériaux : 1 aliquot de 15µL d’ADN plasmide stérile (pGFP-actin à 12ng/µL) 200mL de milieu LB stérile à température ambiante (dans un erlenmeyer couvert de papier d’aluminium) 3 pétris gélose LB-ampicilline (50µg/mL) 1 pétri gélose LB 50mL de CaCl2 à 100mM, 4°C Solution saturée de bactéries DH5alpha

dans un plasmide Pbluescript recombinant Email : Groupe 13 Résumer : Cet article à pour but de montrer comment cloner de l'ADN de phage λ avec comme vecteur un plasmide pbluescript. Nous avons pu voir au cour du TP comment utiliser les techniques de clonage moléculaire via un vecteur, la digestion enzymatique avec les enzyme EcoR1 et Hind III, la transgenèse par choc thermique, l'électrophorèse sur gel d'agarose, et la minipréparation a l'aide du kit d'extraction de plasmide. Les résultat

Titre : Sous-Clonage d’un fragment d’ADN dans un vecteur bactérien Matériel biologique : Plasmide PSK Plasmide PCR-gai Enzymes de restriction : EcoRI, HindIII, Xho Introduction : Le clonage d'un gène est une grande technique en biologie moléculaire, c'est une opération consistant à isoler un gène, l'introduire dans un vecteur et à le reproduire en grande quantité. Parfois il est nécessaire d’effectuer un sous clonage permettant d’insérer dans un nouveau vecteur un fragment d'ADN de l’insert

surtout sur les manipulations qui aboutissent a l’obtention des clones de ce fragment .Une digestion de l’ADN du bactériophage lambda et du plasmide (pBluescript) s’est faite par des enzymes de restriction au début de l’expérience afin d’obtenir plusieurs fragments à bouts cohésifs. Une ligation est réalisée entre les fragments afin d’obtenir des plasmides recombinés. C es derniers ont été introduits dans des bactéries thermo-compétentes pour le clonage. Afin de bien vérifier la réussite des pratiques

la deuxième étape.  La fabrication du plasmide : Après avoir repéré le gène, les scientifiques doivent préparer un plasmide*. Dans ce dernier, on incorpore le gène d’intérêt que nous avons au préalable récupéré, ainsi qu'un autre gène (souvent un gene de resistance a un herbicide H) et un marqueur, ces deux derniers ayant comme rôle de contrôler la réussite de la transformation génétique  L’incorporation du plasmide dans la bactérie : Le plasmide préparé, il faut maintenant l'insérer,

introduit, tout d’abord, le gène étranger dans un plasmide (ADN bactérien). On utilise pour cela différentes enzymes, notamment la ligase ou une enzyme de restriction qui agit de la même maniè-re. Sous son action, l’ADN est incorporé dans le plasmide lui conférant ainsi de nouvelles caractéristi-ques. C’est alors que l’on obtient un plasmide génétiquement modifié comprenant le gène étranger. * 2ème étape :   Ensuite, on transfère ce plasmide dans une bactérie, provenant en général de l’espèce

gène dans lequel il y a eu une insertion d’ADN (IS), mais également les gènes situés en aval qui dépendent du même promoteur, car l’élément inséré contient des signaux d’arrêt de la transcription). - De l’augmentation de la taille de certains plasmides (due également à l’insertion d’ADN (IS). Il existe deux types d’éléments génétiques transposables (ET) : - les séquences d’insertion (IS) - les transposons (Tn) Ce sont des éléments constitués d’ADN pouvant se déplacer d’un

Laboratoire de Microbiologie et Biologie Moléculaire Extraction et digestion de plasmide d’Escherichia coli Réaliser par: Fatima zahra

transcription des gènes, analyse globale des interactions protéines-protéines.... I. Souches et marqueurs • • Les marqueurs génétiques sont utilisés pour suivre une mutation lors de croisement de souches ou pour sélectioner les cellules ayant inégré un plasmide. Ce sont pour la plupart des marqueurs d’auxotrophie: HIS3, URA3, TRP1, LEU2, LYS2, ADE2 Comme chez E. coli certains gènes de résistance aux antibiotiques peuvent être utilisés: kanamycin resistance, kanR Il existe plusieurs souches de laboratoire

pathogène, sa résistance aux défenses immunitaires humaines ont été encore diminuées ses composants de surface et son équipement enzymatique favorisent l’adhésion, la conservation et l’expression du plasmide dépourvue de plasmides naturels, elle ne peut pas, non plus, après transformation, échanger le plasmide avec d’autres bactéries, ses besoins nutritifs stricts l’empêchent de se développer hors de son milieu de culture au laboratoire, Expliquer l’intérêt des particularités de la souche bactérienne