Absorbance

dispositif dispersif (prisme) : fente sélectionnant une longueur d’onde déterminée : détecteur (cellule photoélectrique) engendrant un courant d’intensité proportionnelle à l’intensité de la lumière reçue. L’intensité de ce courant est traduite en absorbance sur le galvanomètre G. -2- TP Biochimie LV 232 – Année 2009 - 2010 b) Mesure de l’absorbance 1) Choisir une longueur d’onde. Les mesures sont faites de préférence à une longueur d’onde correspondant à un maximum de la courbe ε = f (λ)

CR SDC TJBASTAREAUD Chloé L3 BBMCG BRIQUET Manon Groupe TD1/TP2 DUDON Pauline 24/03/2022 FALLEMPIN Morgane TP d� Biologi� cellulair� Introductio� : Dans ce TP, seront utilisées des lignées cellulaires comme les PC12 qui sont des cellules de phéochromocytome. C’est une tumeur neuro-endocrinienne de médullo surrénale de rat. Elles ont été développées comme lignée cellulaire modèle et elles sont une alternative aux cultures des cellules chromaffines surrénales primaires. Les cellules PC12 peuvent se

violette. La couleur de la solution est proportionnelle à la quantité d’ovalbumine et à l’absorbance. Ce type de dosage permet de mesurer les absorbances à 540nm. 2. Mode opératoire : On prépare une gamme étalon avec une solution d’ovalbumine ayant une concentration connue ensuite on l’incube pendant quelques minutes à l’obscurité. Puis, on mesure les absorbances des solutions à 540nm à l’aide d’un spectrophotomètre. A la fin, on trace le courbe étalon afin de déterminer la concentration en protéines

donc les retrancher. Pour ce faire, on mesure l’absorbance de la cellule avec du solvant et on soustrait l’absorbance ainsi obtenue (le blanc) à l’absorbance mesurée avec l’espèce que l’on veut étudier. Ceci est rendu possible par l’additivité des absorbance (§ 5.2). Il est nécessaire de faire un blanc lorsqu’on utilise un appareil monofaisceau. Remarque : Lorsqu’on analyse une substance en effectuant un balayage en longueur d’onde pour déterminer par exemple λmax, longueur d’onde où l’absorption est

spectrophotomètre, on obtient la courbe donnant l’absorbance A en fonction de la longueur d’onde  pour cette solution diluée de menthe. Le « blanc » du spectrophotomètre a été effectué avec une cuve remplie d’eau distillée Voici la courbe obtenue : absorbance A Sirop de menthe dilué dix fois 1, 2 1, 1 1,0 0, 9 0, 8 0, 7 0, 6 0, 5 0, 4 0, 3 0, 2 0, 1 0 360 2.1. 400 440 480 520 560 600 640 680 720 longueur d'onde  en nm Que signifie « faire le blanc » du spectrophotomètre ? En vous aidant

conjuguées, son maximum d’absorption n’est pas dans le domaine visible. Il présente des groupes caractéristiques : Les solutions basiques de vanilline ne sont pas colorées. 2.3. 2.3.1. Courbe d'étalonnage A = f(c) (Échelle : 1 cm pour 0,10 en absorbance et 1 cm pour 0,50105 mol.L1 en concentration). 2.3.2. La loi de Beer-Lambert est vérifiée. La courbe représentative de la fonction A = f(c) est une droite passant

de façon linéaire en fonction de la concentration en oNPO-. La réalisation d’une gamme étalon permet de déterminer une absorbance A à une longueur d'onde donnée λ, pour une cuve de spectrophotomètre de longueur donnée, pour une concentration en composé recherché. Cette gamme étalon a donc permis de retrouver la concentration en oNPO- d’une solution à partir de son absorbance ou inversement. E. Gamme étalon : La solution pour laquelle un solvant acide (HCl) a été utilisé est incolore. L'analyse

concentration où on pourra appliquer la loi de Beer-Lambert, généralement pour une absorbance inférieure à 1. Pour cela, préparer des solutions colorées correspondant à 50 ppm, 5 ppm, 0,5 ppm et 0,05 ppm. En déduire un ensemble de 5 concentrations régulièrement espacées qui permettront d'établir une relation linéaire entre l'absorbance A et la concentration C de phosphore. Faire aussi une solution où C= 0. Prendre un point à une absorbance moyenne (entre 0,3 et 0,6) et en faire un spectre complet (A= f(()). Préparer

l’absorbance de la gamme étalon Fiole n° 1 2 3 4 5 Solution mère (mg/L) 0 0,25 0,5 0,75 1,00 0,0085 0,0885 0,187 0,2745 0,363 Absorbance à 700nm À partir de ces données, on a pu réaliser une courbe étalon, a partir de laquelle il sera possible de déterminer les concentrations en phosphore de nos 3 sites de prélèvements. Courbe étalon Absorbance à 700 nm 1,000 y = 0,358x + 0,0053 R² = 0,9993 0,800 0,600 0,3630 0,400 0,2745 0,1870 0,200 0,0885 0,0085 0,000 0 0,25 0,5 0,75

le tableau suivant: Solutions S0 [Cu2+] en mol.L-1 11.a. 0,10 S1 S2 S3 S4 S5 0,080 0,060 0,040 0,020 0,010 V (S0) en mL 10 8 6 4 2 1 V eau en mL 0 2 4 6 8 9 Absorbance 1,21 0.95 0.73 0.49 0.25 0.13 SX 0,57 Enoncer la loi de Beer Lambert. Préciser les unités A = k.c. A absorbance sans unité, k en L.mol-1, c concentration molaire de l’espèce qui absorbe en mol.L-1. 11.b La courbe obtenue vérifie-t-elle la loi de Beer Lambert ? La courbe obtenue est une droite