Constante de Michaelis

du substrat initiale 4) Une enzyme fonctionne avec une constante Michaelienne de l’ordre de 5 mM. Pour 6 minutes de réaction, la moitié de la concentration en substrat utilisé au départ a été transformée. Calculer : a- La constante de vitesse de la réaction b- La vitesse maximale de réaction c- La concentration du produit formé en 15 minutes de réaction pour les conditions suivantes : [S] = 2 mM et [S] = 1 M 5) La constante de Michaélis Km d’une réaction enzymatique est de 40µM. a- Déterminer

COURS DE PHARMACOCINÉTIQUEPHARMACOCINÉTIQUE principe et pratique Frantz Foissac, URC-CIC Cochin Necker DIU infirmiers et TEC en recherche clinique 21 novembre 2014PRINCIPEPharmacocinétique/pharmacodynamie PHARMACOCINETIQUE PHARMACODYNAMIE PK PD Système biologique Médicament PK: ce que fait l’organisme au médicament PD: ce que fait le médicament à l’organismeDéfinitions Pharmacocinétique (PK): • Etude quantifiée du devenir des médicaments dans l’organisme • Elle permet de déterminer les paramètres

la représentation de Michaelis-Menten: (voir annexe 3) Graphiquement nous avons trouvé une valeur de Vmax d’environ 0,024 mM/min Et de fait nous avons pu déterminer Km = 0,0275 mM Cette détermination n’est pas assez précise. En effet, dans la représentation de Michaëlis-Menten, Vmax correspond à la limite de la courbe, du fait qu’il s’agit d’une représentation hyperbolique, or cette limite est inaccessible. Il est alors nécessaire de linéariser l’équation de Michaelis-Menten sous la forme

hyperbole;  Lorsque la concentration du substrat est nulle la vitesse est évidemment 0, donc l’hyperbole passe par l’origine du graphe. 4 5 Cinetique Michaelienne V Vmax Vmax/2 Km [S] 6 Équation de Michaelis-Menten 7 Constante de Michaelis-Menten • [Km] = mol.L-1 • Le Km exprime l’affinité de E pour S : plus il augmente pour son affinité pour S est faible; • Le Km est une caractéristique pour une enzyme et un substrat donné • Une enzyme peut avoir plusieurs Km

réaction enzymatique et l’effet de deux inhibiteurs : l’Ethanol et le Sulfate du cuivre, ainsi que la détermination des paramètres cinétique de l’invertase (enzyme pure) en absence et présence d’inhibiteur. 2. Principe L’étude de l’équation de Michaelis doit se réaliser dans les conditions initiales de la réaction : à un instant donné le substrat doit être saturant et proche que possible à une concentration S0 et le produit de la réaction ne doit pas dépasser 10% pour ne pour éviter le risque

sensible à la chaleur et porta le nom de DIASTASE. 1878-küHNE proposa le nom d’enzyme (Du Grec, zyme:dans la levure),qui en1940 devient universel. Enzymologie 2010/2011 Pr Mohammed Bekkali Université Hassan II Casablanca menu 1913 MICHAELIS donne à la cinétique enzymatique sa forme mathématique. S V  Vmax . Km  S 1926 (Sumner) Cristallisation de l'uréase.  Détermination de la nature protéique des enzymes Enzymologie 2010/2011 Pr Mohammed Bekkali Université Hassan

linéaires (Michaelis-Menten, ...). Il ne faudra donc pas nécessairement relier tous les points expérimentaux entre eux mais plutôt dessiner la meilleure droite ou courbe (selon l’expression mathématique de la relation étudiée), c’est à dire celle qui passe au plus près de ces points. Exemple pour une relation linéaire (dosage colorimétrique) 25 20 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 12 25 20 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 12 Représentation graphique correcte Exemple pour une relation non linéaire (Michaelis Menten)

initiale maximale Vmax. Ainsi pour obtenir des valeurs plus précises nous choisissons de tracer la représentation de Lineweaver-Burk, l’équation de Michaelis en double inverse. Graphiquement, on retrouve Vmax ≈ 14,08·10-9 mol·min-1 KM ≈ 1,82·10-5 M Ces valeurs sont du même ordre que celles trouvées précédemment. On sait d’après l’équation de Michaelis que v = (Vmax ∙ [PNPP]) / (KM + [PNPP]) La vitesse initiale Vmax ne peut être atteinte que si la concentration en substrat est saturante, c’est-à-dire

d'élution du cytochrome (mg de protéine/mL) en fonction du volume cumulé 6- quantité totale de cytochrome récupéré; calcul du rendement de purification. B - Détection de toutes les protéines par la méthode de Bradford : 1- prélèvement d'aliquotes constants dans chacune des fractions 2- coloration à l'aide du réactif de Bradford 3- lecture de l'absorbance 4- tracé du profil d'élution complet : absorbance en fonction du volume cumulé. C - Réponses aux questions. Résultats : analyse du fractionnement

pH, salinité, etc. optimaux [S] >> [E] et temps court ⇒ on cherche à [ES] [E] Tps rester dans les conditions où [S] >> [P] Dans ces conditions, [S] et [ES] sont considérés comme des constantes : c’est la phase stationnaire. On observe deux parties : 1) pente constante ⇒ vitesse constante, puis 2) apparition progressive d’un plateau ⇒ vitesse diminue : les conditions initiales ne sont plus vérifiées, en particulier à cause de l’épuisement du substrat [P] [E] = 3 [E] = 2