Plasmide

purification et clivage de la protéine de fusion Glutathion-S-transférase-Isocitrate déshydrogénase (GST-IDH), exprimée par le plasmide pGEX-IDH dans la souche transformée E. coli JM103/pGEX-IDH, avec pGEX est en réalité pGEX-2T. I. Détermination de la taille de l’insert IDH I.1- Construction du plasmide pGEX-IDH L’insertion/ligation du fragment IDH dans le plasmide pGEX-2T a nécessité que l’insert IDH et le vecteur soient clivés par les mêmes enzymes de restriction (ou compatibles). Le vecteur

séquence-spécifique des endonucléases de restriction est présentée dans le manuel MCB, Classic Experiment 7.2 dans le CD-ROM. Les bactéries possèdent des systèmes de protection vis à vis l'ADN exogène des phages ou vis-à-vis l'ADN porté sur des plasmides provenant de bactéries différentes. Les endonucléases de restriction reconnaissent de courtes séquences spécifiques, généralement des palindromes de 4 à 8 pb, et coupent généralement à l'intérieur de ces séquences. Ceci permet donc de couper tout

plus longs, relient deux bactéries et sont voies d'échanges de matériel génétique entre les bactéries. Les bactéries capables de produire des pili sexuels sont dénommées bactéries "mâles" à l'opposé des autres qui sont dites "femelles". Les plasmides Les plasmides sont de petits éléments circulaires constituant du matériel génétique extra-chromosomique. Ils sont faits d'ADN et portent, comme le chromosome, des informations génétiques. Ils sont autonomes et capables de se répliquer indépendamment du

manipulations génétiques (transmission à l’homme). Ceci incita les scientifiques à les suspendre dès 1974. De nombreux débats eurent lieu, des règles de sécurité furent instaurées et les expériences de génie génétique ne reprirent qu’en 1976. En 1977, les plasmides sont découverts. Ils servent à une bactérie de vecteur pour transférer un fragment d'ADN dans le génome d'une plante. Quelques années plus tard cette méthode sera utilisée pour créer les premières plantes transgéniques. En 1978, un gène humain codant

recombinaison de l'acide désoxyribonucléique impliquant la formation de nouvelles combinaisons de matériel génétique par l'insertion de molécules d'acide nucléique, produit de n'importe quelle façon hors d'un organisme, à l'intérieur de tout virus, plasmide bactérien ou autre système vecteur et leur incorporation dans un organisme hôte à l'intérieur duquel elles n'apparaissent pas de façon naturelle, mais où elles peuvent se multiplier de façon continue ; techniques impliquant l'incorporation directe

représentations culturelles et spirituelles sur ce qu’est la vie et ce qu’est l’être humain. II-Technique Techniques de transfert direct : La transformation directe consiste en l'introduction dans l’ADN d'un gène véhiculé le plus souvent par un plasmide classique, par le biais de techniques physico-chimiques. Il existe plusieurs techniques de transfert direct que nous allons expliciter : l’électroporation, la micro-injection et la biolistique. 1 – L’électroporation : L'électroporation est une

Identifier et isoler le gène d'intérêt Obtention d'un mélange de fragments d'ADN. Identification d'un gène dans un mélange de fragments Réaliser et amplifier une construction génique Insertion d'un fragment d'ADN dans un plasmide Introduction du plasmide modifié dans le génome de la cellule hôte. Transférer de l'ADN Introduction d'un ADN étranger ou remplacement d'un fragment d'ADN Contrôler l'efficacité du transfert chez l'hôte Sélectionner des cellules

connues. La quantité d’ADN total déposé dans les puits 1 et 2 est le double de celle des puits 3 et 4. Après coloration par le bromure d’ethidium**, l’image suivante est obtenue. * On rappelle qu’un cosmide est un vecteur artificiel constitué d'un plasmide auquel a été ajouté le site COS du bactériophage lambda. L'intérêt des cosmides réside dans le fait qu'ils permettent le clonage de fragments d'ADN de grande taille soit environ de 45kpb. ** Le bromure d'éthidium (BET) une molécule aromatique

blot et d’ELISA). Concepts clefs et difficultés attendues : Distinguer techniques acides nucléiques et techniques protéines. Distinguer séquence codante des autres. Distinguer vecteurs d’expression et vecteurs de clonage. Organisation d’un plasmide et étapes d’un sous-clonage : à reconstituer à partir d’éléments épars dans le TP Bonnes pratiques en biologie : importance des contrôles positifs et négatifs (ex digestion ER) Sécurité des personnes et de l’environnement. Evaluation :

étapes de la transgénèse La transgénèse s'effectue en 4 étapes. Elle s'effectue sur des vecteurs de transformation appelés plasmides qui sont des petits fragments circulaire d'ADN qui portent un certain nombre de gène. Des enzymes de restriction sont utilisées et permettent le découplage de l'ADN en des sites spécifiques. Ces enzymes vont permettre de découper le plasmide ou le gène que l'on souhaite y insérer. Prenons le cas d'une plante transgénique pour laquelle les 4 étapes de la transgénèse