Séphadex

CHROMATOGRAPHIE D'EXCLUSION SUR GEL DE SEPHADEX INTRODUCTION : On se propose au cours de ce TP de séparer un mélange de deux macromolécules protéiques de masses moléculaires différentes (SAB et cytochrome c ) par méthode de chromatographie d'exclusion sur gel séphadex (G50) en déterminant les caractéristiques de notre colonne par exclusion grâce au dextran bleu , de vérifier ensuite notre séparation par spectrométrie et de doser par méthode de Lowry et al nos fraction obtenue .

rouge indique une réaction positive. II. CHROMATOGRAPHIE D'EXCLUSION DIFFUSION But et principe Sephadex (marque déposée par Pharmacia Fine Chemicals) est un dextran modifié. Les macromolécules de dextran sont réticulées pour former un réseau tri-dimensionnel de chaînes de polyosides. Sephadex se présente sous forme de petites perles qui gonflent considérablement dans les solutions aqueuses. Séphadex est disponible en grains de grosseurs différentes. Les grains très fins (qualité superfine) sont

c’est-à-dire le volume de phase mobile externe aux granules du gel dans la colonne et reliés à des tubes capillaires pour rendre les pics plus précis. Il existe différents types de gels dans les colonnes. Les plus fréquents sont les gels hydratés, dont le Séphadex et le Sépharose. EXPLIQUER? Ce sont des polysaccarides de type dextran. Il existe aussi les gels permanents qui ajoutent des effets d’absorption au tamisage des molécules. Ces gels permanents sont des minéraux ou des copolymères organiques. Ainsi

Filtration sur SEPHADEX® G-25 Lors du J3 nous avons utilisé du sel [ SO2(NH4+) ] pour précipiter sélectivement les protéines. L'extrait obtenu (C48) est deux fois plus concentré que l'extrait du départ, seulement, la présence du sel pourrait déranger une éventuelle purification plus poussée. Lors de cette séance nous allons séparer les protéines du sel et nous allons déterminer le niveau de pollution par les acide nucléiques. Le principe de la filtration: Les billes de SEPHADEX® sont faites

utiliserons un gel appelé Sephadex G50 (le terme Sephadex est un nom générique donné par la firme qui le produit et le chiffre G50 reflète le pouvoir d'exclusion). Un gel de Sephadex est constitué de billes de polysaccharides hydratés. Mises en suspension dans l'eau ou dans un tampon, ces billes gonflent fortement en prenant l'aspect d'un gel. Le gel est un réseau poreux dans lequel les molécules de soluté s'engagent d'autant plus que leur taille est faible. Le Sephadex G50 utilisé ici permet la

préparations sont centrifugées à 7000 rpm pendant 15 minutes à 4°C. Les surnageants sont éliminés, les 3 culots sont séchés avant d’être remis en suspension dans 0,5 mL de Tampon 1. La fraction F1 est ainsi préparée. 2. Dessalage par filtration sur Sephadex G25 La colonne PD10 (fournit par la professeur) est équilibrée avec 30 mL de tampon 1 (1X). Une fois que le tampon pénétre dans le gel, 0,5 mL de F1 sont déposés sur le gel et entrent dans la colonne. La solution de tampon 1 est de nouveau déposée

Adsorbant (phase stationnaire) Verre fritté Robinet d’élution La quantité d'adsorbant est telle qu'il occupe une hauteur égale à environ 10 fois le diamètre de la colonne. Prévoir un espace de 10 cm environ au-dessus de a T e l il Billes de sephadex Protéines diffusent en s’attachant (+/-) affinité /site Temps de rétention  ou  a T e l il Les biomolécules large (PM ) n’entre pas dans les mailles du gel (phase stationnaire) et sont éluées + rapidement Les biomolécules fines (PM ) rentrent

l'ordre croissant de leur pI. Première séance : chromatographie d'exclusion Méthode : ici, on cherche à séparer trois molécules en fonction de leur taille. On utilise donc une chromatographie d'exclusion. La colonne contient une résine de type Séphadex formant un réseau tridimensionnel. On y dépose l'échantillon qui contient les trois molécules (xylène cyanole, vitamine B12, bleu dextran) Les molécules sortiront dans l'ordre des masses moléculaires décroissantes. La collecte de chacune des molécules

taille, soit une forme, soit une masse molaire différente. On utilise comme phase stationnaire c'est à dire phase solide, des gels séphadex. Un gel séphadex est un sucre, formé de longue chaîne ==> polyoside, et on va fabriquer comme des microbilles, synthétisés à partir du polyoside. La taille des pores est la même dans une microbille. Si j'achète un gel séphadex G-10, ça veut dire que je pourrais tamiser des molécules ayant un poids moléculaire (sans unité) compris entre 0 et 700. G-200 -->

Exercices de chromatographie : Exercice 1 : On détermine les temps de rétention (tr) au cours d'une chromatographie sur Sephadex, des protéines suivantes dont on connaît la masse moléculaire (MM) (Le débit de la colonne est de 5 ml / min) : MM tr (min) Aldolase 145000 10,4 Lactate déshydrogénase 135000 11,4 Phosphatase alcaline 80000 18,4 Ovalbumine 45000 26,2 Lactoglobuline 37100 28,6 1 - Calculer les volumes d'élution (Ve) correspondants. Porter le log de MM en fonction de Ve - Que remarquez-vous