Enzyme De Restriction

transgénèse s'effectue en 4 étapes. Elle s'effectue sur des vecteurs de transformation appelés plasmides qui sont des petits fragments circulaire d'ADN qui portent un certain nombre de gène. Des enzymes de restriction sont utilisées et permettent le découplage de l'ADN en des sites spécifiques. Ces enzymes vont permettre de découper le plasmide ou le gène que l'on souhaite y insérer. Prenons le cas d'une plante transgénique pour laquelle les 4 étapes de la transgénèse vont être effectués : -> La

 TP de Biologie Moléculaire Séparation d’ADN par électrophorèse analytique et préparative Objectif L’objectif de ce TP est de préparer et d’extraire l’ADN plasmidique pUC18-wzc à partir d’une souche d’E.coli pour établir une carte de restriction, puis de réaliser une électrophorèse en gel d’agarose afin d’isoler le fragment Eco RI/ Bam HI (wzc). Principe Préparation de l’ADN plasmidique La préparation de l’ADN plasmidique est réalisée à partir d’une souche d’E.coli cultivée à

Etude du clonage dans le plasmide pBluescript de l’ADN du phage lambda. Mots clés : Enzyme de restriction, EcoR1, HindIII, vecteur de clonage, ADN recombinant, plasmide, pBluescript, électrophorèse, transformation, LacZ, bactérie, phage lambda. Résumé : L’ADN peut faire l’objet de multiples travaux. Ici notre objectif est de cloner des morceaux de l’ADN du phage lambda dans le vecteur (plasmide) pBluescript. Pour se faire nous aurons recours à différentes techniques comme la digestion

répliquent grâce aux enzymes présents dans la bactérie. Les plasmides Le chromosome C/ Les enzymes de restriction Les enzymes de restriction sont une sorte de ciseaux moléculaires servant à couper l'ADN en des sites bien précis. Le nom des enzymes de restriction provient de la bactérie dont elles ont été isolées, par exemple Eco RI provient d'Escherichia coli souche R, le I signifie que c'est la première enzyme qui a été découverte. D/ L’ADN ligase Une ligase est une enzyme capable de

dans un vecteur permettant ainsi d’en obtenir plusieurs copies An Introduction to Genetic Analysis Procédure complète Questions? •Comment obtenir l’ADN de l’organisme donneur ? Quelles informations porte cet ADN? •Qu’est ce qu’une enzyme de restriction? •Quels sont les vecteurs de clonage? •Comment l’ADN d’intérêt et le vecteur sont-ils liés? •Les cellules hôtes •Comment l’ADN recombinant est introduit dans une cellule hôte et comment celle-ci se multiplie? •Les intérêts du clonage

Il correspond à de l’ADN circulaire extra chromosomique présentant une origine de réplication (il se sert de la bactérie dans laquelle il est pour se répliquer). Le plasmide possède également des sites des restrictions correspondant à des sites de reconnaissance pour des enzymes des restrictions (cela permet d’insérer ce que l’on veut étudier). On va insérer le plasmide dans une bactérie. Certaines vont l’insérer d’autres non. Pour faire le tri, on se sert de la présence d’une séquence de résistance

dénaturation-renaturation de l'ADN, principe des techniques d'hybridation. Mise en évidence de la présence d'enzymes de restriction par Linn et Arber. Élucidation du code génétique par Nirenberg, Ochoa et Khorana. Découverte de l'ADN ligase par Arthur Kornberg. Démonstration par Hamilton Smith (Nobel 1978) que les enzymes de restrictions clivent l’ADN de façon séquence-spécifique. Utilisation des enzymes de restriction bactériennes pour couper et coller l'ADN dans des vecteurs plasmidiques par Boyer, Cohen et Berg. Transfert

bactérienne, X-gal Le clonage moléculaire nécessite des enzymes de restriction capables de couper l’ADN (exp2), et de l’ADN ligase capable de recoller les fragments d’ADN. La ligase a été isolée pour la première fois à partir du bactériophage T4. Cette enzyme est impliquée dans la réparation et la réplication de l’ADN. Elle peut lier des fragments d’ADN ayant des bouts collants (exp2) compatibles. A plus grande concentration, cette enzyme est également capable de lier deux bouts francs d’ADN

technologique du début des années 70 I.Des outils pour manipuler le génome 1°) Découper l'ADN grâce à des enzymes de restriction a-Principe d'action b-Réalisation d'une carte de restriction 2°) Séparer les fragments grâce à l'électrophorèse 3°) Repérer un fragment grâce à une sonde radioactive (Western Blot) II.La naissance du génie génétique 1°) Le clonage de gènes a-Grâce aux enzymes b-Par PCR 2°) Le séquençage du génome III.L'évolution du concept de gène 1°) Les particularités du gène

La digestion séparée du plasmide par les enzymes HindIII, EcoRI et PstI achevée, il faut ajouter la solution de charge avec ses 2 indicateurs de migration le bleu de bromophénol qui migre comme un fragment d'ADN de 500 pb et le xylène cyanol qui se déplace comme un fragment de 5000 pb. Un échantillon avec le plasmide non digéré est également préparé ainsi qu'un marqueur de taille (ADN du phage l digéré par HindIII). Cinq dépôts sont effectués, chacun dans un puits du gel d'agarose puis l'électrophorèse