Gentiane

arrondies…) ; - la taille ; - le mode de regroupement ; - l’homogénéité de la forme et de la couleur. Mode opératoire : • réaliser un frottis et le fixer (voir fiche technique n°4) ; • plonger la lame dans le violet de gentiane (ou cristal violet) pendant 1 minute ; • plonger la lame dans une solution de lugol pendant 1 minute ; • rincer à l’eau distillée les deux faces de la lame ; • décolorer dix secondes à l’alcool (face vierge d’abord puis frottis) ;

membrane externe supplémentaire. L’observation se fait au microscope optique à l’objectif x100 avec de l’huile à immersion. Principe des réactions biochimiques Le violet de gentiane traverse la paroi et les membranes des bactéries puis colore le cytoplasme. Le Lugol provoque une combinaison chimique entre le violet de gentiane et les composants cytoplasmiques des bactéries et fixe ainsi la coloration dans le cytoplasme. L’alcool traverse uniquement la paroi des bactéries gram – et décolore le cytoplasme

identification. En effet, le violet de gentiane se fixe sur des composants cytoplasmiques et après ce temps de coloration, toutes les bactéries sont violettes. Chez les bactéries à Gram négatif, la paroi, riche en lipides, laisse passer l'alcool (ou le mélange alcool + acétone) qui décolore le cytoplasme alors que, chez les bactéries à Gram positif, la paroi constitue une barrière imperméable à l'alcool et le cytoplasme demeure coloré en violet. Réactifs : - Violet de gentiane phénique - Lugol (iodo-iodure

de plusieurs colorants et une différenciation à l’alcool-acétone au cours de la coloration. Les bactéries Gram + ont une paroi plus riche en peptidoglycane que la paroi d’une bactérie Gram – qui possède en plus une membrane externe. Le violet de gentiane colore toutes les bactéries et le lugol fixe ça. Intervient alors la différenciation, avec l’alcool acétone qui décolore la paroi plus fine des Gram – et permet à la contre coloration, la fuschine, d’être effective sur elles. On peut alors observer

de différencier et de classer les bactéries éventuellement présentes. 1) Préparation : - Frottis préalablement fixé sur lame ; - Recouvrir complètement la lame de violet de gentiane, puis laisser agir pendant tente (30) secondes ; - Une fois le délai écoulé, chasser le violet de gentiane avec du Lugol en recouvrant complètement la lame. Laisser agir pendant trente (30) secondes ; - Egoutter la solution et rincer à l’eau du robinet ; - Verser de l’alcool sur le frottis

leur aptitude à fixer le violet de gentiane (Gram +) ou la fuschine (couleur rose) (Gram -). Son avantage est de donner une information rapide sur les bactéries présentes dans un produit ou un milieu tant sur le type que sur la forme. Mode opératoire : y y y y y y y y y y y Réaliser un frottis ou un étalement Fixer la préparation à la flamme, sécher soigneusement puis laisser refroidir la lame. Immerger les lames dans la solution de Violet de Gentiane pendant 1mm. Lavage à l'eau en transvasant

le hasard ne favorise que les esprits préparés » comme aimait à le rappeler Pasteur. Dans une note de son article du 15 mars 1884 (Fig.1) pour “Fortschritte der Medicin”, HCJ Gram rapporte que des préparations colorées à l’aniline et au violet de gentiane sont totalement et rapidement décolorées par l’alcool après avoir été traitées avec de l’iode et de l’iodure de potassium. HCJ Gram ajoute : “j’avais essayé de faire une coloration double : sur des tissus de reins et sur des cylindres urinaires”

GÉLOSE C.L.E.D. (CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT) 1. Contexte d’utilisation La gélose C.L.E.D. est un milieu couramment utilisé au cours de l’étude bactériologique des urines. Ce milieu non sélectif est aussi utilisé pour le dénombrement de l’ensemble des bactéries non exigeantes présentes dans des urines (il constitue une des deux faces du système DGU® : Dénombrement des Germes Urinaires). Elle permet de différencier les espèces fermentant le lactose de celles qui ne le fermentent pas. La

d’un frottis – Dépôt des bactéries sur la lame Réalisation d’un frottis – Séchage du frottis Réalisation d’un frottis – Fixation à l’alcool Réalisation d’un frottis – Flambage à l’alcool Coloration de GRAM – Coloration au violet de gentiane Coloration de GRAM – Mordançage au lugol Coloration de GRAM – Décoloration à l’alcool Coloration de GRAM – Coloration à fuchsine Coloration de GRAM – Séchage de la coloration V Manipulations : Premier jour 1) Prélèvement de

Coloration de Gram et observation au microscope de différentes bactéries But de la manipulation: Le but est d'apprendre à réaliser un frottis pour prélever des bactéries dans leur milieu afin de pouvoir les observer au microscope. Le but est également d'apprendre à réaliser des colorations afin de déterminer si les bactéries possèdent une paroi Gram + ou Gram -. Mode opératoire du frottis (excepté pour la préparation du 4 mars): -Travail en milieu stérile (autour de la flamme bleue