Tp Electrophorese

TP Biologie Moleculaire (Biol 347) Rapport Final De TP realisé par: •Ramy Meouchy 60952 •Amer Choueib 61122 Première Séance: Extraction de l’ADN plasmidique Bactéries Utilisées : E.Coli dans un milieu de culture LB (boite de pétri contenant des bactéries ayant déjà subit la transformation). Les différentes étapes de l’expérience : a) Lyse des cellules bactériennes. b) Déproteinisation c) Enlèvement de L’ARN: traitement Rnase d) Précipitation de l’ADN But : ADN une fois extracté, on peut l’amplifier

1. But du TP L’objectif de ce TP est de purifier une solution contenant de nombreuses protéines afin de récolter l’enzyme lactate déshydrogénase et déterminer son activité spécifique. 2. Principe La lactate déshydrogénase (LDH) est l’enzyme catalysant la réaction : L-lactate + NAD+ Pyruvate + NADH + H+ Elle existe sous 5 formes rmes d’isoenzymes qui différent par leur pH isoélectrique. ➢ Chromatographie d’affinité Afin de la purifier un extrait de tissu fœtal bovin contenant

de la pyruvate et de la lactate accompagnée de la conversion concomitante du NADH en NAD+ (et inversement). Ce tétramère est composé de 4 sous unité (isoenzyme) différents de par leurs constance cinétiques et leurs pH isoélectriques. Le but de ce TP est de purifier la LDH (ici de façon partielle) au moyen d'une chromatographie d'affinité en colonne. Le principe de la chromatographie d'affinité repose sur l'attirance entre l'enzyme et sont substrat. On choisit ici d'isoler l'enzyme sur gel de

gène, l'introduire dans un vecteur et à le reproduire en grande quantité. Parfois il est nécessaire d’effectuer un sous clonage permettant d’insérer dans un nouveau vecteur un fragment d'ADN de l’insert déjà cloné et isolé par ailleurs. Lors de notre TP nous avons sous-cloné à partir de pCR-gai la moitié 5’ du gène GAI (un gène d’Aradopsis thaliana code pour un facteur de transcription impliqué dans la voie de signalisation des hormones gibbérellines) dans le vecteur pSK afin de créer le nouveau plasmide

TP correction : Le dépistage du SIDA Les anticorps sont des molécules capables de se fixer de manière spécifique sur d’autres molécules. Lors de la contamination par le virus du SIDA, les anticorps produits au cours de la réaction immunitaire acquise sont des anticorps anti-VIH, c’est-à-dire des anticorps capables de se fixer spécifiquement sur des antigènes propres au VIH (protéines virales typiques). Problème : Comment dépiste-t-on la séropositivité au VIH? Activité 1 : Le test Elisa

TP – Séparation de l’albumine du sérum par chromatographie d’affinité I) But Le but de ce TP est l’extraction de l’albumine du sérum humain. II) Principe On effectue pour cela une chromatographie d’affinité. Le sérum est déposé dans une colonne à chromatographie contenant une résine de Bleu Sépharose CL-6B, spécifique à l’albumine, et est élué à l’aide de 2 tampons différents. Lors du lavage, où l’on utilise le tampon A, les protéines non spécifiques ne sont pas retenues dans la résine et sont

Trait. Anti coagulant Tt anticoagulant et/ou posologie – à renseigner I.N.R. TP TCA Héparinémie Fibrinogène 2.0-3.0 >65 23-36 0.20-0.30 2.50-5.00 % s U/ml g/l Normes CH CAHORS 09/12 -3- NORMES BIOLOGIQUES Electrophorèse Albumine Alpha 1 Alpha 2 B 1 globulines B 2 globulines Gamma globulines Graphe Commentaire 36-48 2.1-3.5 5.1-8.5 3.4-5.2 2.3-4.7 8.0-13.5 {A} g/l g/l g/l g/l g/l g/l {A}Graphe électrophorèse Normes CH CAHORS 09/12 -4- 

(TAT) de Rat, par PCR et son sousclonage dans le vecteur d’expression pGEM-T Amplification de l’ADNc Tyrosine Amino Transférase (TAT) de Rat, par PCR et son sous-clonage dans le vecteur d’expression pGEM-T. I) Introduction : L’objectif de ce Tp est de sous cloner l’ADNcomplémentaire à l’ARNm codant pour la Tyrosine Amino Transférase de Rat. Pour cela, l’ADNc sera inséré dans un plasmide et pourra donc être transcrit in vitro en ARN qui sera utilisé comme sonde pour étudier l’expression du

807 4. Intérêt du plasmide pUT 807 II. Principe des méthodes utilisées. 1. La PCR 2. Intérêt de la PCR et conditions opératoires 3. Réactions enzymatiques : restriction et ligation 4. Electrophorèse en gel d’agarose a) Migration/Séparation b) Conditions opératoires c) Visualisation d) Purification III. Résultats et discussion 1. Gel 1

I/ Résumé Durant ce TP, des molécules d'ADN ont été clonées, c'est-à-dire que leur quantité a été amplifiée. Ce clonage a été réalisé par transformation bactérienne à partir de plasmide Blue Script et de phage lambda digérés par des enzymes de restriction. A l'issue de cette manipulation ont été obtenus des plasmides transformés et recombinés. II/ Introduction Le but du clonage est de produire de grandes quantités d'ADN à partir d'un fragment donné. Ainsi une petite quantité d'une molécule